Статьи, зарегистрированные в Medline/Pubmed, опубликованные в отчетах по семинарам Института Питания Нестле (NNI) и материалах Нестле

Основы науки о питании

Мыактивноразвиваем науку о питании и поддерживаем профессионалов системы здравоохранения во всем мире, начиная с 1981 г.

Анализ состава и метаболизм олигосахаридов грудного молока у детей первого года жизни

Клеменс Кунц^a, Сильвия Рудольф^a,b

^aИнститут нутрициологии и b Отделение педиатрии, Гиссенский Университет Юстуса Либиха, Гиссен, Германия

Серия семинаров Института питания Нестле, том 88, стр. 137–147, 2017.

Можно считать настоящим успехом то, что сегодня нам доступны биотехнологические методы, позволяющие производить достаточные количества некоторых олигосахаридов грудного молока (ОГМ) со степенью чистоты, необходимой для проведения исследований метаболизма и функций этих веществ даже у человека. Недавно были получены данные, указывающие на существование связи между группой крови по Льюису и статусом секретора, а также определенными воспалительными заболеваниями. В этой связи в данной работе подробно рассматриваются вопросы, связанные с метаболическими преобразованиями компонентов, характерных для секреторов и людей с разными группами крови по Льюису. Мы пришли к выводу, что не существует простой схемы выведения из организма ОГМ с мочой или фекалиями, хотя по особенностям состава мочи во многих случаях можно судить о принадлежности матери к «секреторам» или «несекреторам». Тем не менее, отдельные ОГМ характеризуются определенной спецификой, что заслуживает особого внимания. Вариабельность состава экскрементов гораздо выше, чем мочи, что может быть связано с различиями микробиоты кишечника ребенка первого года жизни. Ранее существовала точка зрения, что с течением времени происходит постепенное снижение выведения ОГМ, однако это представление не подтвердилось, так как даже после 7 месяцев исключительно грудного вскармливания интактные ОГМ часто обнаруживаются в фекалиях и моче. Кроме того, было установлено присутствие LNT, основной структуры ОГМ, во всех случаях обнаружения олигосахаридов в фекалиях. Следовательно, полученные нами данные не подтверждают гипотезу о том, что LNT является предпочтительным субстратом для развития микробиоты.

Уже примерно в 1900 г., одновременно с открытием лактобактерий и бифидобактерий, а также их значения для обеспечения здоровья и развития заболеваний, педиатры поняли, что микробиологический состав проб фекалий детей, получающих грудное и искусственное вскармливание различается. Наблюдения показали, что это различие было связано, главным образом, с углеводной фракцией молока. данный факт стал отправной точкой исследований, посвященных изучению углеводов грудного молока. В середине прошлого века Ричард Кун (Richard Kuhn), работавший в Гейдельберге (Германия) впервые обнаружил олигосахариды грудного молока (ОГМ) [1]. В то же время, исследования Пола Гьерджи (Paul György) в Гейдельберге и позднее в Филадельфии (США) были сосредоточены на изучении различных ОГМ в контексте их связи с ростом бифидобактерий в грудном молоке (Рис. 1) [2]. В ходе исследований было описано примерно 150–200 отдельных ОГМ.

В последние годы произошло впечатляющее увеличение объема наших знаний о специфических эффектах ОГМ [3–10]. Уже опубликованы результаты первых исследований по изучению формул для искусственного вскармливания, обогащенных отдельными ОГМ, в которых участвовали дети [11, 12]. Для того, чтобы определить, какой компонент (ы) наиболее оптимальны для обогащения, в каких концентрациях и сочетаниях, а также как долго следует их применять, необходимы исследования по изучению метаболических преобразований ОГМ, их местных и системных эффектов.

Прямой стратегией исследования метаболизма ОГМ является определение наличия или отсутствия олигосахаридов грудного молока в фекалиях, крови, моче или тканях. Однако некоторые обстоятельства препятствуют реализации этого простого подхода: например, образцы ткани и крови невозможно или очень трудно получить при обследовании детей первого года жизни. Кроме того, не удается преодолеть методологические сложности обработки большого количества проб, в связи с чем требуется разработка стандартизированных методов.

В данной статье мы сначала кратко остановимся на сложностях, возникающих при анализе состава ОГМ, после чего будут рассмотрены метаболические аспекты по материалам разных исследований, целью которых было изучение процесса выведения олигосахаридов с фекалиями и мочой.

На сегодняшний день еще не разработаны стандартизированные методы для рутинного анализа, и именно это является одной из основных проблем, обусловливающих получение несоответствующих друг другу качественных и количественных данных, публикуемых в материалах разных исследований. Для идентификации ОГМ недавно начали применять разные методы, такие как хроматография на бумажной подложке, жидкостная хроматография высокого разрешения (HPLC) в сочетании с масс-спектрометрией (MS), HPAEC-PAD (ионнообменная хроматография высокого разрешения), HPLC/чип MS, капиллярный гель-электрофорез/методы лазерной индукции флуоресценции, или жидкостная хроматография-HPLC-MS. Все эти методы позволяют детально изучать паттерн олигосахаридов в отдельных пробах молока, часто наряду с более подробной информацией об относительном количестве отдельных изомеров. Однако большая часть этих методов требует сложной и длительной подготовки, что является препятствием для проведения анализа большого количества проб.

Несмотря на последние методологические достижения, позволяющие описать следовые количества ОГМ и продуктов их распада в биологических пробах, высокая степень структурного разнообразия ОГМ осложняет получение ответа на вопрос «Какие структуры важны для здоровья детей первого года жизни?».

Исследования по изучению метаболизма могут помочь определить, действительно ли ОГМ всасываются и утилизируются в организме ребенка. Более того, профиль олигосахаридов в фекалиях может служить маркером здоровья кишечника детей первого года жизни по причине известной связи между микробиотой и количеством сложных гликанов в кишечнике. Мониторинг выведения с мочой может дополнить наблюдения, проведенные в ходе исследований, посвященных изучению системных эффектов олигосахаридов.

Только недавно были опубликованы результаты научных работ, цель которых заключалась в том, чтобы попытаться доказать наличие прямой связи между структурами ОГМ и их пребиотической функцией in vivo у детей первого года жизни. Недавнее исследование для подтверждения концепции выявило связь между составом фекальных ОГМ и микробиотой кишечника у 2 детей, находящихся на грудном вскармливании, в течение определенного периода времени, хотя оба параметра значительно различались у обоих детей [19]. В другом исследовании была показана связь между фекальным микробиомом детей, находящихся на исключительно грудном вскармливании, и составом ОГМ молока, которое использовалось для кормления [20].

Что касается количественных аспектов, данные различных лабораторий в значительной степени варьируют [13–17]. Часто применяются разные методы MS, кроме того, концентрации приводятся в виде относительных величин. Однако, MS вряд ли можно рекомендовать для количественного анализа, при этом интерпретация таких данных требует осторожности [18]. Помимо прочего, такой анализ связан с необходимостью получения производных, например, путем перметилирования или мечения флуоресцентными реагентами, что делает исследование громоздким. Из-за сложностей количественного анализа эффективность преобразований необходимо доказывать после каждого этапа исследования. Кроме того, следует учитывать тот факт, что часто требуется длительный процесс обработки пробы с различными этапами центрифугирования и/или экстракции с использованием разных картриджей перед тем, как проба сможет быть изучена на приборе MS. Результативность требований, применяемых к исследованию, может отличаться, например, в зависимости от индивидуальных предпочтений или особенностей лаборатории. Вышеуказанные проблемы, безусловно, нуждаются в срочном решении.

Ввиду значительных различий по таким показателям как профиль ОГМ и состав микробиоты, только результаты четко спланированных исследований по изучению структуры и функции могут помочь понять, как ОГМ и микробиота связаны со здоровьем и болезнью.

Первые исследования фекальных олигосахаридов и возможных метаболитов ОГМ у детей первого года жизни были опубликованы группой Лундблада (Lundblad) в 1970-х годах [21]. Последние исследования, в которых применялись новые технологии, проводились либо с участием небольшого количества детей первого года жизни, либо базировались на данных недоношенных детей, функция кишечника которых может очень существенно отличаться от здоровых доношенных детей [22, 23].

Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют сделать вывод, что основная часть ОГМ достигает нижних отделов желудочно-кишечного тракта, где они могут использоваться как питательные вещества разными микроорганизмами, или могут влиять на активность микрофлоры. Оставшиеся количества выводятся в неизменном виде или в виде метаболитов с фекалиями или мочой. На основании этих сведений можно предположить, что не существует единого метаболического процесса для всех ОГМ [5, 24, 25].

На Рисунке 2 представлены примеры, связанные с потреблением, метаболизмом и потенциальными функциями ОГМ, обсуждаемыми в настоящее время.

Для дополнительного улучшения заменителей грудного молока с целью обеспечения максимального эффекта ОГМ часто поднимается вопрос о том, сколько отдельных компонентов следует добавлять в формулы. В этом контексте следует отметить, что, по результатам некоторых исследований, необходимо различать молоко, которое появляется после срочных и преждевременных родов, поскольку считается, что в последнем случае молоко содержит больше ОГМ. То есть, паттерн состава ОГМ в молоке, образующемся после преждевременных родов, отличается от молока, которое вырабатывается после срочных родов [15, 23].

Как уже указывалось, мы не обнаружили различий по общему количеству ОГМ между молоком, которое образуется после срочных и преждевременных родов, ни при изучении молозива, ни при исследовании переходного или зрелого молока. Пример состава зрелого молока приводится на Рисунке 3 a [16].

Однако часто при обследовании большой группы проб не проводится различия между молоком, которое вырабатывается в организме женщин-секреторов и несекреторов, этот аспект обсуждается далее.

В течение длительного времени отмечалось, что паттерн ОГМ зависит от генетики матери, то есть, группы крови по Льюису и статуса секретора или несекретора (Таблица 1) [26, 27]. Этот аспект особенно важен, так как кормление ребенка молоком с другим паттерном ОГМ может снизить или увеличить риск развития определенных заболеваний.

При анализе одной группы проб молока, образующегося после срочных и преждевременных родов (Рисунок 3 a), с учетом статуса секретора/несекретора и группы крови матери по Льюису, становится очевидно, что существуют значительные различия между пробами молока (Рис. 3 b, c). Различия между отдельными ОГМ в обеих группах, а также группах крови по Льюису a, b и негативными пробами по Льюису, рассматриваются более подробно в работе Kunz et al. [16].

Мы провели 2 исследования с применением стабильных изотопов для анализа молока, фекалий, мочи, а также проб дыхательного теста при каждом акте сосания в течение периода до 36 ч после применения перорального болюса с 13 C-меченой глюкозой или галактозой, которую давали матерям в период лактации [28–31]. Далее представлены некоторые результаты наряду с данными, полученными в 2 других исследованиях с выделением когорт [16, 32].

Наши данные подтверждают вывод о том, что общий паттерн нейтральных олигосахаридов в моче детей, находящихся на грудном вскармливании, отражает паттерн молока матери, что указывает на значимую корреляцию с группой крови матери по Льюису и фенотипом секретора. Основное различие между молоком матерей с группой крови по Льюису a, b и 0,  это довольно сложный паттерн молока «Льюис b» по сравнению с «Льюис a» и «Льюис ноль» [25, 31, 32, 33]. При сопоставлении паттерна ОГМ молока «Льюис a» или «Льюис b» с паттерном олигосахаридов мочи этих же детей, наблюдался сходный паттерн с теми же значениями молекулярных масс [25, 30, 31].

Используя метод MALDI-TOF (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация)-MS, можно было визуализировать различия по интенсивности сигнала при изучении как молока, так и мочи, хотя массы m/z 730 (LNT, LNnT), 876 (монофукозилированная LNT/LNnT), или 1022 (дифукозилированная LNT/LNnT), как и другие, присутствовали во всех пробах. Поскольку лакто-N-фукопентаоза (LNFP) I характерна для молока «Льюис b», можно было бы ожидать, что m/z 876, основной сигнал массы, соответствует этому компоненту; однако, при помощи MS нельзя точно установить соответствие различным изомерам. При проведении анализа фракции с помощью HPAEC с пульсовой амперометрической детекцией, что позволяет отделить ОГМ изомеры, такие как LNFP I и II, мы не смогли выявить LNFP I ни в одной из изученных проб мочи от детей, получавших молоко матерей «Льюис b» [25, 31].

Более того, можно было бы ожидать, что специфичные для статуса секретора ОГМ присутствуют только в фекалиях или моче детей первого года жизни, которых кормили молоком от «матерей-секреторов» или «Льюис b». Однако мы обнаружили специфичные для статуса секретора олигосахариды 2’FL, DFLT, а также LNDFH I, не только в моче и фекалиях детей, получавших молоко от матери секретора, но часто, в том числе, у тех детей, которых кормили молоком женщины несекретора [25]. Эти данные соответствуют отчетам исследований Лундблада (Lundblad [21]) по изучению фекалий и Де Леоз с соавторами (De Leoz et al. [35]) по изучению мочи.

Кроме того, и в противоположность другим публикациям, мы выявили LNT и LNnT, 2 структуры обычно обнаруживаемые в грудном молоке, в пробах мочи многих младенцев. Примечательно, что LNT и LNnT были обнаружены во всех пробах фекалий, где присутствовали ОГМ. Однако в других отчетах по исследованию фекалий было отмечено отсутствие LNT в пробах детей, находящихся на грудном вскармливании, в разные моменты времени [22, 35].

Можно сделать вывод, что не существует простого паттерна выведения ОГМ с мочой или фекалиями, хотя особенности выведения с мочой часто соответствуют статусу секретора или несекретора матери. Тем не менее, особого внимания заслуживают явные расхождения по некоторым отдельным ОГМ. Вариабельность содержания ОГМ в фекалиях гораздо выше, чем в моче, причиной этого может быть вариабельность состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Простого постепенного снижения выведения ОГМ с течением времени, как предполагалось ранее, не происходит, так как даже после 7 месяцев исключительно грудного вскармливания могут выявляться интактные ОГМ, хотя у большинства детей первого года жизни олигосахариды не обнаруживаются. Кроме того, мы установили присутствие LNT, основной структуры ОГМ, во всех случаях обнаружения олигосахаридов в фекалиях. Следовательно, наши данные не подтверждают предшествующей точки зрения, согласно которой LNT является предпочтительным субстратом для микробиоты.

В целом, в желудочно-кишечный тракт ребенка, получающего грудное молоко, попадают большие количества ОГМ, то есть, несколько граммов в день. Примерно 1–5% ОГМ, по всей видимости, выводится с мочой [19, 28, 29, 31, 36]. При определении количества отдельных ОГМ в моче, можно обнаружить примерно 50–160 мг LNT или LNFP II, что является четким показателем предшествующего всасывания ОГМ [30].

Следовательно, в крови ребенка циркулируют несколько сот миллиграмм ОГМ в день. В этой связи можно ожидать, что ОГМ могут вызывать не только местные, но и системные эффекты.

Представленные данные ставят на повестку дня вопрос о том, что имеется в виду, когда грудное молоко считают «золотым стандартом», если рассматривать понятие стандарта применительно к составу ОГМ. Существуют значительные различия по общему количеству и профилю отдельных ОГМ, что может быть обусловлено генетикой матери. Является ли качество грудного молока более низким, если в нем отсутствуют определенные ОГМ, как в случае с несекреторами, к которым относится примерно 20% популяции? Заслуживают ли дети матерей-несекреторов особого внимания, если предположить, что они могут подвергаться более высокому риску развития определенных заболеваний? Следовательно, может быть задача заключается не только в выявлении ОГМ с самыми выраженными полезными эффектами для большинства детей первого года жизни, но также в том, чтобы определить риск (с точки зрения поддержания здоровья/развития болезни) для детей первого года жизни на основании зрелости/незрелости на момент рождения, а также установить их генетические характеристики, для получения максимально возможной пользы от обогащения питания за счет добавления ОГМ.

Конфликт интересов отсутствует.

Олигосахариды грудного молока: функции в организме ребенка и вопросы, требующие изучения

Ларс Боде

Отделение неонатологии и Отделение гастроэнтерологии и нутрициологии, Отделение педиатрии, Университет Калифорнии, Сан Диего, Ла Джолла, США

Серия семинаров Института питания Нестле, том 90, стр. 191-201, 2019.

Олигосахариды грудного молока (ОГМ) являются третьим по количеству компонентом грудного молока. До настоящего времени выявлено более 150 различных и различающихся структурно ОГМ. Состав ОГМ значительно различается у разных женщин, однако остается постоянным в течение всего периода лактации у одной женщины. В настоящее время не совсем понятно, какие именно генетические факторы организма матери и экологические причины определяют индивидуальные различия в составе ОГМ, кроме того, пока неизвестно, действительно ли специфический состав ОГМ формируется у женщины для максимально полного удовлетворения особых потребностей ее собственного ребенка. Для того, чтобы в полной мере оценить многочисленные эффекты, функции и возможность декларирования заявлений, связанных с ОГМ, необходимы доклинические, клинические исследования и исследования с выделением когорт.

В некоторых случаях отдельные ОГМ вызывают определенные эффекты и, несмотря на возможность некоторой избыточности, такого рода эффекты часто в значительной степени специфичны для определенной структуры. В других случаях для получения эффекта необходимо сочетание разных ОГМ в определенных соотношениях, в связи с чем требуется дополнительное изучение для оценки того, является или нет применение только одного ОГМ контрпродуктивным и потенциально опасным для здоровья ребенка первого года жизни в краткосрочной и отдаленной перспективе. В целом, персонализированная сложность ОГМ не может быть воспроизведена в формулах для искусственного вскармливания детей первого года жизни, что является еще одним весомым поводом для защиты, распространения и поддержания практики грудного вскармливания.

В одном литре зрелого грудного молока содержится 5-15 г сложных углеводов, которые называются олигосахаридами грудного молока (ОГМ). Высокая концентрация превращает ОГМ в третий по количеству твердый компонент зрелого молока, в котором содержится большее количество только лактозы и общих липидов, при этом ОГМ часто превышают концентрацию белков [1]. Для сравнения, концентрация олигосахаридов в коровьем молоке от 100 до 1000 раз меньше, и многие олигосахариды коровьего молока в структурном отношении отличаются от ОГМ и являются менее сложными. Несмотря на то, что к настоящему времени выявлено более 150 разных ОГМ, их состав соответствует базовой схеме, предусматривающей соединение пяти строительных элементов, а именно глюкозы (Glc), галактозы (Gal), N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), фукозы (Fuc), а также Nацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), в специфических положениях (Рисунок 1A) [2]. Все ОГМ содержат лактозу (Galβ1- 4Glc) на восстановленном конце. Лактоза может удлиняться в положении C3 Gal либо лакто-N-биозой (Galβ1-3GlcNAc, цепь 1 типа), либо N-ацетиллактозамином (Galβ1-4GlcNAc, цепь 2 типа) Это на первый взгляд незначительное отличие в связи между Gal и GlcNAc может иметь большое значение для переваривания и биодоступности ОГМ. В то время как β1-3 связь в лакто-N-биозе (1 тип) не может быть расщеплена βгалактозидазой (лактазой) кишечника ребенка, связь β1-4 в Nацетиллактозамине (2 тип), скорее всего, является субстратом для фермента. Это указывает на то, что цепь 2 типа такого ОГМ как лакто-N-неотетраоза (LNnT) частично расщепляется в проксимальном отделе кишечника ребенка первого года жизни, не достигает дистального отдела кишечника и толстой кишки, и, следовательно, не доступна для всасывания или утилизации микроорганизмами. Напротив, цепь 1 типа ОГМ, например, лактоN-тетраозы (LNT), не поддается расщеплению лактазой, сохраняется интактной в тонком кишечнике ребенка, может достигать толстой кишки в неизменном виде и быть доступной для всасывания или использования микроорганизмами. В дополнение к удлинению цепи в положении C3 Gal, дисахариды лакто-N-биоза или N-ацетиллактозамин также могут присоединяться в положении C6 Gal, результатом чего является разветвление цепи.

Многократное добавление дисахаридов к растущей цепи приводит к образованию более сложной линейной или разветвленной молекулы ОГМ (Рисунок 1D). Более того, ОГМ могут модифицироваться за счет добавления Fuc к связи α1-2-, α1- 3-, и/или α1-4 и/или добавления Neu5Ac к связи α2-3- и/или α2-6. Каждая молекула Neu5Ac содержит карбоксильную группу и привносит негативный заряд в ОГМ. В результате присоединения Fuc или Neu5Ac к лактозе образуются небольшие трисахариды 2’- фукозиллактоза (2’FL), 3-фукозиллактоза (3’FL), 3’-сиалиллактоза или 6’-сиалиллактоза (Рисунок 1E). Добавление одной или более молекул Fuc и/или Neu5Ac к растущей линейной или разветвленной цепи ОГМ приводит к образованию сложной молекулы ОГМ с потенциально большим количеством отрицательных зарядов, если происходит присоединение более одной молекулы Neu5Ac (Рисунок 1F). ОГМ, содержащие Neu5Ac, часто относят к «кислым».

Хотя состав ОГМ соответствует определенной схеме, и к настоящему моменту описано более 150 различных ОГМ, важно отметить, что в организме каждой женщины синтезируется и секретируется определенный профиль ОГМ, который в значительной степени индивидуален для каждой женщины, однако остается довольно постоянным в течение периода лактации у одной и той же женщины.

Некоторые вариации в составе ОГМ могут быть объяснены генетическими факторами организма матери [1]. Фукозилирование ОГМ, в основном, катализируется двумя разными фукозилтрансферазами, ферментами, которые облегчают присоединение Fuc к оси молекулы ОГМ в различных положениях [3,4]. Фукозилтрансфераза 2 (FUT2) добавляет Fuc к Gal в положении связи α1-2 [5]. Мутации в гене «Секретор», который кодирует FUT2, приводят к инактивации этого фермента и, как следствие, пробы молока так называемых женщин несекреторов имеют очень низкие концентрации α1-2- фукозилированных ОГМ, например 2’-FL или лакто-Nфукопентаоза 1 (LNFP1). Фукозилтрансфераза 3 (FUT3) добавляет Fuc к Gal или GlcNAc в положении связи α1-3- или α1-4, в зависимости от того, относится ли субстрат к 1 или 2 типу цепи [6]. Мутации в гене Льюиса, который кодирует FUT3, приводят к инактивации фермента, и, как следствие, пробы молока от женщин, которые относятся к группе 0 по системе Льюиса, имеют очень низкие концентрации α1-3/4-фукозилированных ОГМ.

Комбинирование активных/неактивных ферментов FUT2 и FUT3 приводит к образованию четырех групп ОГМ [4]: i. Льюисположительные секреторы (активные FUT2 и FUT 3), ii. Льюисположительные несекреторы (неактивные FUT2, но активные FUT3), iii. Льюис-отрицательные секреторы (активные FUT2, но неактивные FUT3), а также iv. Льюис-отрицательные несекреторы (неактивные FUT2 и FUT3). Эти четыре группы различаются по наличию или практическому отсутствию специфических фукозилированных ОГМ, что соответствует феномену, описываемому схемой «все или ничего». Например, 2’FL либо присутствует и является одним из доминантных ОГМ в молоке женщин-секреторов (активные FUT2), или практически полностью отсутствует в молоке женщин-несекреторов (неактивные FUT2). Напротив, вариация ОГМ, которая не зависит от активности FUT2 или FUT3 изучена хуже. Фактически, остается неясным, какие ферменты, отличные от FUT2 и FUT3, участвуют в биосинтезе ОГМ в эпителиальных клетках молочной железы женщины.

Помимо генетических особенностей организма матери и потенциальных эпигенетических факторов, на состав ОГМ также могут влиять факторы, связанные с условиями проживания матери. В ходе недавно проведенного нами экспериментального исследования на мышах было установлено, что концентрации олигосахаридов уменьшаются в тех случаях, когда лактирующая самка получает в качестве питания рацион, богатый жирами, и увеличивается, когда самка испытывает физические нагрузки (неопубликованные данные).

В настоящее время продолжаются исследования, задачей которых является установить, как рацион, физическая активность и другие факторы, связанные со стилем жизни, влияют на состав ОГМ в организме человека. Здоровье матери также может определять состав ОГМ. Предварительные данные позволяют предположить, что на состав ОГМ влияют ожирение или хронические воспалительные заболевания (неопубликованные данные). Кроме того, данные кроссоверного исследования CHILD («Длительный мониторинг развития здоровых детей в Канаде»), проведенного в национальной когорте [7], показывают, что количество детей в семье, в целом, коррелирует с увеличением концентрации ОГМ, при этом не было выявлено связи состава ОГМ с такими факторами как возраст матери, способ родоразрешения или пол ребенка (неопубликованные данные).

После потребления ОГМ остаются устойчивыми к воздействию низкого pH желудка, а также не подвергаются распаду под воздействием ферментов поджелудочной железы и щеточной каемки в тонком кишечнике [8,9]. Исключением, возможно, являются цепи 2 типа, где терминальная часть β1-4-связанного Gal может быть отделена ферментом лактазой. Примерно 1% потребленных ОГМ абсорбируется и может быть измерено в системном кровотоке и моче [10-13]. Это показывает, что воздействия ОГМ распространяются не только на кишечник, но и другие ткани и органы. Большинство ОГМ достигают дистального конца тонкого кишечника и толстой кишки в неизменном виде, там они либо метаболизируются микроорганизмами, либо выводятся с фекалиями.

ОГМ являются метаболическим субстратом для специфических и потенциально полезных бактерий в кишечнике ребенка первого года жизни [14-16], что делает их первыми пребиотиками, с которыми сталкивается организм человека в раннем периоде развития – когда ребенок первого года жизни находится на грудном вскармливании (Рисунок 2A). Однако последние данные исследований ex vivo позволяют предположить, что пребиотические эффекты разных ОГМ не являются взаимно заменяемыми и действительно определяются структурными особенностями (неопубликованные данные). Состав сообществ микроорганизмов, выделенных из проб фекалий ребенка и культивируемых в анаэробных условиях, изменяется с течением времени в зависимости от того, какие именно ОГМ добавляют в культуру. Например, состав сообщества микроорганизмов очень отличается в условиях добавления либо смеси ОГМ, выделенных из объединенных проб молока, либо отдельных ОГМ, таких как 2’FL или LNT. Поскольку различия в составе и активности сообществ микроорганизмов ассоциируются с такими заболеваниями как ожирение, диабет, воспалительное заболевание кишечника или аутизм, воздействие на организм ребенка отдельного ОГМ, содержащегося в формуле, вместо сложной смеси ОГМ в грудном молоке, может увеличивать риски развития заболеваний. Для исключения этого потенциального риска, а также чтобы избежать возможного причинения вреда здоровью ребенка первого года жизни как в краткосрочной, так и отдаленной перспективе, необходимы исследования, предусматривающие длительные контрольные наблюдения.

Однако ОГМ представляют собой нечто большее, чем просто «пищу для микробов». ОГМ могут оказывать непосредственно бактериостатическое или бактерицидное воздействие (Рисунок 2B). Например, ОГМ тормозят рост Streptococcus agalactiae (группа B Streptococcus; GBS) [17], эти микроорганизмы являются главным патогеном, вызывающим инвазивные бактериальные инфекции у новорожденных, обычно с вертикальным типом заражения в процессе родов, что является процессом, вторичным по отношению к колонизации кишечника вагинальной микрофлорой матери. Передача GBS новорожденному связана с риском таких заболеваний как пневмония, септицемия, а также менингит [18- 20]. Многомерная хроматография позволила обнаружить, что бактериостатический эффект связан со структурой, и что LNT является наиболее эффективным веществом. Скрининг в библиотеке мутантов транспозона GBS показал, что гликозилтрансфераза GBS является одной из мишеней ОГМ. Еще более интригующим является синергия эффектов ОГМ и обычных антибиотиков, таких как ванкомицин и ципрофлоксацин, что имеет большое значение в контексте такой проблемы как активно развивающаяся резистентность к антибиотикам [17].

ОГМ также проявляют антиадгезивные эффекты (Рисунок 2C). Многим патогенам для пролиферации и возможности проникновения в ткани организма-хозяина требуется прикрепление к поверхности эпителия. Процесс прикрепления часто облегчается за счет воздействия поверхностных молекул патогена, которые присоединяются к гликановым структурам на поверхности эпителиальных клеток, известным как гликокаликс. ОГМ и гликаны на поверхности эпителиальных клеток обладают общими структурными чертами, что позволяет ОГМ мимикрировать под поверхностные эпителиальные гликаны и выполнять функции ложных рецепторов. Патогены, вместо связывания с поверхностью эпителиальных клеток и провоцирования заболевания, связываются с растворимыми ОГМ, играющими роль ложных рецепторов, и вымываются после прикрепления, не причиняя вреда. К примерам антиадгезивных эффектов ОГМ относятся бактериальные патогены, такие как Campylobacter jejuni [21] или энтеропатогенные E. coli (EPEC) [22], а также протозойные паразиты, такие как Entamoeba histolytica [23].

ОГМ также могут оказывать прямое воздействие на эпителиальные клетки, не зависящее от микроорганизмов, но влияющее на них опосредованно (Рисунок 2D). Например, эпителиальные клетки мочевого пузыря после воздействия ОГМ становятся значительно более устойчивыми к уропатогенной инвазии E. coli и цитотоксичности [24]. ОГМ также могут изменять реакции иммунных клеток, локально в кишечнике или на системном уровне (Рисунок 2E).

В заключение следует отметить, что ОГМ действуют опосредованно в организме ребенка первого года жизни за счет изменений сообществ микроорганизмов, например, выполняя функции пребиотиков, антимикробных препаратов или веществ, препятствующих адгезии патогенов, а также непосредственно, например, изменяя ответные реакции эпителиальных или иммунных клеток. Кроме того, могут существовать многие другие механизмы действия ОГМ, которые еще не описаны. В целом, арсенал эффектов ОГМ представляется важным в контексте обеспечения здоровья или развития болезни.

Результаты исследований на культурах тканей, экспериментов на животных или клинических исследований с участием женщин, где предусмотрено выделение когорт, позволяют предположить, что ОГМ оказывают положительное воздействие на организм ребенка, получающего грудное молоко. Однако результаты многих подобных исследований ставят на повестку дня дополнительные вопросы. Насколько релевантны результаты, полученные в исследованиях in vitro или в экспериментах на животных? Насколько сходны клеточные линии и ткани в организме ребенка? Насколько сопоставимы эксперименты на животных с учетом особенностей анатомии, физиологии и патофизиологии человека? Насколько значимы ассоциации между ОГМ и итоговыми показателями развития ребенка в исследованиях с выделением когорт по изучению человека? Являются ли наблюдаемые ассоциации истинными причинноследственными связями? Скорее всего, ни одно исследование не сможет дать исчерпывающий ответ на эти вопросы. Напротив, для полной оценки многочисленных эффектов, функций ОГМ, а также обоснования заявлений, связанных с действием ОГМ, необходима реализация тщательно спланированной поисковой стратегии, сочетающей доклинические исследования в культурах тканей и эксперименты на животных, клинические исследования с анализом данных когорт, и, наконец, клинические интервенциональные исследования. Выполненная нами недавно работа по изучению некротизирующего колита (NEC) служит примером того, как сочетание доклинических исследований и исследований с участием человека с анализом когорт может стимулировать проведение клинических интервенциональных исследований для проверки гипотезы, что ОГМ вносят вклад в положительные эффекты кормления грудным молоком.

NEC является одним из самых распространенных и фатальных желудочно-кишечных заболеваний у недоношенных детей [25]. Примерно у 5% всех детей с очень низким весом при рождении (VLBW) развивается NEC, при этом смертность достигает более 25%. В то время как дети, находящиеся на искусственном вскармливании, подвергаются в 6-10 раз более высокому риску развития NEC [26], защитные механизмы, обеспечиваемые грудным вскармливанием, до сих пор изучены недостаточно. В отличие от формул для искусственного вскармливания, грудное молоко содержит большое количество ОГМ.

Кроме того, превентивный эффект донорского молока против NEC сохраняется даже после пастеризации, процесса, который разрушает и инактивирует многие биологически активные компоненты грудного молока, но при этом ОГМ остаются интактными и сохраняют активность. На основании этих наблюдений мы выдвинули гипотезу, что ОГМ влияют на снижение встречаемости развития NEC у детей первого года жизни, получающих грудное вскармливание, а также проверили гипотезу в эксперименте на новорожденных крысах [27]. Новорожденных крысят либо оставляли с самкой, и в этом случае они служили контрольной группой «получающей грудное вскармливание», либо отнимали от самки и кормили формулой перорально и принудительно. В то время как все крысята, которых кормила самка, выжили после 4 дней, только ~75% крысят из группы получения формулы остались в живых. Однако, 95% крысят выживали, если они получали формулу, обогащенную ОГМ, выделенными из объединенных проб молока. Это значительное увеличение выживания совпадало с уменьшением количества патологических наблюдений, как макроскопических, так и микроскопических. Затем мы применили метод многомерной хроматографии для разделения разных ОГМ сначала по заряду, затем по размеру, и идентифицировали один специфический ОГМ, дисиалиллакто-N-тетраозу (DSLNT), содержащий две молекулы Neu5Ac, который и вызывал полезные эффекты. Удаление с помощью фермента всего лишь одной Neu5Ac приводило к полной утрате функций. Это показывает, что эффект в значительной степени зависит от структуры [27].

В то время как полученные данные производят благоприятное впечатление, ценность имеющихся доклинических моделей исследований NEC на грызунах или поросятах можно считать ограниченной [28]. Животные подвергаются внешнему гипоксическому и/или гипотермическому воздействию, которое является не вполне естественным, кроме того, использование животных само по себе можно считать недостатком по причине межвидовых различий в развитии желудочно-кишечного тракта, анатомии и физиологии. Таким образом, продвижение возможных препаратов типа DSLNT на основании противоречивых результатов доклинических исследований сразу в клиническую практику несет в себе чрезвычайно высокий риск получения неудачных исходов лечения. Чтобы сократить разрыв между экспериментами на животных и клиническими интервенциональными исследованиями, мы использовали промежуточный подход и провели многоцентровое клиническое проспективное исследование с выделением когорт и участием матерей и их детей из группы VLBW, которые получали, преимущественно, грудное молоко [29]. Исследование основывалось на наблюдении, что у некоторых детей первого года жизни развивается NEC несмотря на преимущественное кормление грудным молоком. Поскольку состав ОГМ характеризуется индивидуальной вариабельностью, это привело нас к предположению, что дети, у которых развивается NEC, получали молоко с меньшим содержанием DSLNT, чем дети, у которых не было зафиксировано NEC. В наше исследование было рекрутировано 200 матерей и их детей с очень низким весом при рождении, которых кормили, преимущественно, грудным молоком. Мы проанализировали состав ОГМ в грудном молоке, которое получали дети в течение первых 28 дней после рождения, сравнили каждый случай NEC с пятью контролями, а также использовали логистическую регрессию и общее уравнение, чтобы показать, что концентрации DSLNT были значительно меньше почти во всех пробах молока во всех 8 случаях NEC по сравнению с контролями. Фактически, количество DSLNT позволяет определить случаи NEC до того, как будут заметны признаки заболевания. Совокупная оценка DSLNT в течение нескольких дней позволила еще четче разделить случаи NEC и контроли, что позволяет считать содержание DSLNT в грудном молоке потенциальным неинвазивным маркером для идентификации детей из группы риска развития NEC. В то время как только данные по ассоциациям в когортах могут сопровождаться вопросами относительно причинноследственной связи, сочетание этой информации и данных доклинических исследований существенно повышает уверенность в том, что наблюдаемые эффекты действительно связаны с DSLNT, что снижает риск неудачи клинического интервенционального исследования.

В целом, проект изучения NEC является примером того, как сочетание доклинических данных и результатов, полученных в клинических исследованиях с выделением когорт, может стимулировать и направлять клинические интервенциональные исследования (Рисунок 3). аналогичный подход использовался в прошлом для того, чтобы выявить связь ОГМ со снижением встречаемости инфекции, вызываемой Campylobacter jejuni, и диареей [21,30], и используется в настоящее время для изучения влияния ОГМ на состав тела ребенка и риск детского ожирения, а также риск развития аллергии и астмы.

Применив описанный комбинированный подход, мы узнали, что иногда отдельные ОГМ являются эффективными, и эти эффекты обычно зависят от структуры и дозы. Лежащие в основе механизмы, скорее всего, опосредованы специфическими рецепторами на клетках тканей организма-хозяина (в данном случае ребенка) или микроорганизмов. В других случаях для достижения эффекта необходимо сочетание разных ОГМ в определенных соотношениях. Эффекты, скорее всего, опосредуются через формирование сообществ микроорганизмов или непосредственно через скоординированное взаимодействие разных ОГМ с многочисленными различными рецепторами или даже разными типами клеток, например иммунной системы. В ситуациях, когда относительная представленность многих разных ОГМ значит больше, чем присутствие какого-либо одного специфического ОГМ, возникает вопрос, действительно ли специфический состав ОГМ в грудном молоке женщины сформировался для удовлетворения потребностей именно ее ребенка. В этом случае ОГМ можно рассматривать как еще один пример индивидуализированного питания в раннем периоде жизни, помимо других персонализированных компонентов грудного молока, таких как антитела, микробиота молока, иммунные клетки, а также клетки-предшественники. Фактически, индивидуальная сложность ОГМ является дополнительным доводом в пользу защиты, продвижения, а также поддержки практики грудного вскармливания.

Автор заявляет, что исследование было проведено без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые можно считать потенциальным конфликтом интересов.

Влияние олигосахаридов грудного молока на иммунитет слизистой кишечника и системный иммунитет новорожденных

Шэрон М. Донован^a, Сара С. Комток^b

^aОтделение нутрициологии и питания человека, Университет Иллинойса, Эрбана, Иллинойс, а также

^bОтделение нутрициологии и питания человека, Мичиганский государственный университет, Ист Лансинг, Мичиган, США

Материалы Нестле том 74, №3, 2016, стр. 42-51.

• Олигосахариды грудного молока (ОГМ) являются его преобладающим компонентом и представляют собой молекулы с разнообразными структурами, имеют нейтральную или кислую реакцию, при этом некоторые формы сиалированы или фукозилированы, что влияет на их биологические функции.
• ОГМ защищают организм ребенка первого года жизни от патогенных инфекций, способствуют формированию микробиоты кишечника, стимулируют развитие кишечника и иммунной системы.
• Некоторые типы ОГМ в настоящее время доступны в продаже, их добавляют в формулы для искусственного вскармливания отдельно или в сочетании с другими пребиотиками.

Олигосахариды грудного молока, иммунитет, ребенок первого года жизни

Иммунная система ребенка первого года жизни является функционально незрелой и характеризуется наивностью, то есть неспособностью к распознаванию чужеродных агентов. Грудное молоко содержит биоактивные белки, липиды, а также углеводы, которые защищают новорожденного и стимулируют развитие врожденного и адаптивного иммунитета. Этот обзор посвящен рассмотрению роли олигосахаридов грудного молока (ОГМ) в развитии и функционировании желудочно-кишечного тракта и иммунной системы у детей первого года жизни. В течение последнего десятилетия проводились интенсивные исследования для определения сложного состава олигосахаридов в молоке многих видов животных, и в настоящее время их разнообразные функции становятся более понятными. Согласно полученным данным, грудное молоко содержит более высокую концентрацию ОГМ, которые характеризуются большей степенью структурного разнообразия и фукозилирования, чем олигосахариды молока других видов млекопитающих, в частности, коровьего молока, из которого производятся формулы для искусственного вскармливания детей первого года жизни. Коммерческая доступность больших количеств некоторых ОГМ способствовала углублению нашего понимания их функций, к которым относится защита организма ребенка первого года жизни от патогенных инфекций, оптимизация формирования микробиоты кишечника, обеспечение развития кишечника, а также стимулирование созревания иммунной системы. Многие указанные функции реализуются посредством углевод-углеводного взаимодействия с патогенами или клетками организма-хозяина. Два ОГМ, 2’- фукозиллактоза (2’FL) и лакто-N-неотетраоза (LNnT), недавно начали добавлять в формулы для искусственного вскармливания. Хотя это первый шаг на пути приближения состава формулы для искусственного вскармливания к грудному молоку, остается неясным, действительно ли добавление 1 или 2 ОГМ позволит добиться той же степени сложности эффектов, которые обеспечиваются присутствием сложной смеси ОГМ, потребляемой детьми, находящимися на грудном вскармливании. По мере появления в продаже большего количества ОГМ, либо выделенных из коровьего молока, либо синтезированных химическим путем или микроорганизмами, ожидается, что большее количество олигосахаридов будет добавляться в формулы для искусственного вскармливания отдельно или в сочетании с другими пребиотиками.

Ребенок рождается с функционально наивной иммунной системой, что влияет на реакции адаптивного и врожденного иммунитета[1] и подвергает новорожденного высокому риску развития распространенных инфекций. Постанатальное созревание иммунной системы стимулируется воздействием антигенов и взаимодействиями организма-хозяина и микроорганизмов [1, 2]. Как и что ребенок первого года жизни получает в качестве питания влияет на развитие и компетентность иммунной системы [3–5]. Грудное молоко защищает ребенка в течение уязвимого периода жизни, обеспечивая биоактивными компонентами, препятствующими развитию патогенной инфекции, поддерживает развитие кишечника, способствует формированию барьерной функции, стимулирует развитие иммунитета, облегчает развитие иммунной толерантности, а также служит питанием для микроорганизмов, населяющих кишечник [2–5]. Таким образом, грудное молоко обеспечивает многоуровневую систему защиты для ребенка первого года жизни.

Грудное вскармливание, в частности, исключительно грудное вскармливание в течение 6 месяцев или более, по сравнению с формулой для искусственного вскармливания, снижает встречаемость и/или степень тяжести инфекционных заболеваний [6]. Многие заболевания с инфекционными и иммунными этиологическими компонентами, включая диарею, инфекции органов дыхания и мочевыводящих путей, отит среднего уха, бактериемию, а также некротизирующий энтероколит, отмечаются реже у детей, находящихся на грудном вскармливании, по сравнению с теми, кто получает искусственное вскармливание [6, 7]. Грудное вскармливание также ассоциируется со снижением встречаемости других заболеваний, вовлекающих иммунную систему и иммунную толерантность, таких как воспалительное заболевание кишечника, глютеновая болезнь, астма, аллергия, диабет 1 типа, острая лимфобластная и острая миелобластная лейкемия [6, 8]. Эти полезные эффекты могут быть частично опосредованы влиянием грудного вскармливания на микробиоту кишечника [8, 9], которая, в свою очередь, стимулирует созревание и специфичность неонатального иммунитета слизистой и иммунной системы в целом [2].

Пользу грудного вскармливания для иммунной системы отчасти объясняли разнообразием биоактивных компонентов, содержащихся в грудном молоке [2–5]. Подтверждением может служить ключевая роль олигосахаридов грудного молока (ОГМ) в развитии и созревании системы защиты в неонатальном периоде. Как описывается далее, ОГМ присутствуют в высокой концентрации в грудном молоке, характеризуются невероятным структурным разнообразием [10–13], а также обеспечивают защиту организма ребенка и опосредуют иммунные реакции посредством определенных механизмов [14, 15].

ОГМ представляют собой сложные растворимые гликаны, которые находятся в молоке, преимущественно, в свободной форме. Эти гликаны синтезируются из 5 основных моносахаридов: галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, фукозы, а также производной сиаловой кислоты Nацетилнейраминовой кислоты [10, 11]. За несколькими исключениями, все ОГМ содержат лактозу (Galβ1–4Glc) на восстановленном конце, которая может элонгироваться в положении связи β1–3 или β1–6 2 разными дисахаридами, либо Galβ1–3GlcNAc (цепь 1 типа), либо Galβ1–4GlcNAc (цепь 2 типа) [11].

Сообщалось, что содержание ОГМ варьирует от 1 до 10 г/л в зрелом молоке и от 15 до 23 г/л в молозиве [10–13]. В грудном молоке, которое образуется после срочных родов, ~35–50% ОГМ фукозилированы, 12–14% сиалированы, а 42–55% являются нефукозилированными и нейтральными [10–13] (Таблица 1). Однако на состав ОГМ влияют генетические особенности организма матери, включая статус секретора и группу крови по Льюису [10, 11]. Фукозилирование ОГМ происходит при участии 2 фукозилтрансфераз FUT2 (ген секретора) и FUT3 (ген Льюиса). В организме матерей несекреторов, у которых отсутствует функциональный фермент FUT2, к которым относится примерно 30% женщин во всем мире, вырабатывается молоко, в котором отсутствуют α1-2-фукозилированные олигосахариды, такие как 2α - фукозиллактоза (2’ FL) и лакто-N-фукопентаоза (LNFP) I [10, 11]. Отсутствие этих веществ может иметь функциональные последствия. Например, у детей, потребляющих молоко, производимое женщинами несекреторами, происходит более поздняя колонизация кишечника бифидобактериями, в организме присутствует больше таксонов Streptococcus, а также отмечаются функциональные различия в метаболической активности микробиоты [16]. Дети, получающие молоко матерей несекреторов, подвергаются более высокому риску заболеваний, сопровождаемых диареей [17].

Развитие микробиоты кишечника у ребенка первого года жизни  это последовательный процесс, который начинается внутриутробно и продолжается в течение первых 2–3 лет жизни. Состав и разнообразие видов бактерий формируется под влиянием генетики организма ребенка и многочисленных экологических факторов, из которых рацион является определяющим [8, 9]. Исследования, проведенные в течение последнего десятилетия, показали, что определенные виды Bacteroides и Bifidobacterium, которые обычно колонизируют кишечник детей, находящихся на грудном вскармливании, эффективно используют ОГМ в качестве источника углерода. Это, в частности, верно для B. longum ssp. infantis (B. infantis ), вида, который доминирует в микробиоме кишечника большинства детей, находящихся на грудном вскармливании [18]. Обнаружение участка генома у B. infantis, кодирующего специфические ферменты для метаболизма ОГМ, подтверждает адаптацию этого вида к среде кишечника ребенка, находящегося на грудном вскармливании [18, 19]. Действительно, недавно проведенное исследование по изучению детей, получающих формулу для искусственного вскармливания, обогащенную 2’ FL (1 г/л) и LNnT (0.5 г/л), показало, что общий состав микробиоты детей первого года жизни, получавших формулы для искусственного вскармливания с 2’ FL и LNnT, в значительной степени отличался от микробиоты детей, которым давали формулу для искусственного вскармливания без добавок (p < 0.001) на уровне рода микроорганизмов, и был ближе к составу микробиоты детей, находящихся на грудном вскармливании, в возрасте 3 месяцев [20]. Кроме того, отмечалось преобладание Bifidobacterium (p < 0.01), тогда как Escherichia и неклассифицированные Peptostreptococcaceae встречались реже у детей, получавших формулу для искусственного вскармливания с 2’ FL и LNnT, по сравнению с детьми, получавшими необогащенную формулу для искусственного вскармливания. Кроме того, наблюдаемые уровни были ближе к показателям детей, находящихся на грудном вскармливании [20]. Более того, концентрации нескольких важных метаболитов в фекалиях (пропионат, бутират и лактат) у детей, получавших обогащенную ОГМ формулу для искусственного вскармливания, в большей степени соответствовали показателям детей, находящихся на грудном вскармливании [20].

Ранее экспериментальным образом нами было показано, что ферментирование ОГМ неонатальной микробиотой поросят приводило к образованию короткоцепочечных жирных кислот и способствовало росту полезных бактерий in vitro [21] и in vivo [22]. Бактерии кишечника и реакция иммунной системы, в частности, иммунной системы желудочно-кишечного тракта, тесно связаны [23]. Таким образом, в этом эксперименте удалось показать, что индуцированные ОГМ изменения в популяциях бактерий кишечника поросят могут изменять течение кишечной инфекции [24], что, в свою очередь, может изменить реакцию иммунной системы [22]. С другой стороны, изменение бактерий кишечника может непосредственно влиять на иммунную систему этих животных [2]. Дополнительные способы, посредством которых ОГМ могут влиять на неонатальный иммунитет, описываются далее.

На Рисунке 2 представлены объединенные результаты исследований, демонстрирующие, что ОГМ косвенно и непосредственно влияют на иммунитет слизистой и системный иммунитет у ребенка первого года жизни. В целом, здоровье кишечника и его барьерная функция считаются первой линией защиты, обеспечиваемой врожденным иммунитетом. Пролиферация клеток происходит в криптах, при этом клетки дифференцируются по мере миграции вверх по оси ворсинкакрипта, за исключением клеток Панета, мигрирующих вниз к основанию крипты. ОГМ снижают пролиферацию клеток в криптах кишечника [25, 26], интенсифицируют созревание клеток кишечника [26], а также улучшают барьерную функцию [26] (показано цифрами 1–3 на Рис. 2). Слой, сформированный гликопротеинами слизистой или муцинами, продуцируемыми бокаловидными клетками, действует как смазка и защитный физический барьер между эпителием кишечника и содержимым его просвета (показано цифрой 4 на Рис. 2). ОГМ могут влиять на функционирование бокаловидных клеток, как было показано на примере галактоолигосахаридов (GOS) [27]. ОГМ воздействуют на экспрессию гена иммунитета эпителия как непосредственно [28– 30], так и косвенно через микробиоту [31] (показано цифрами 5 и 6 на Рис. 2, соответственно). Как указывалось выше, ОГМ выполняют функцию пребиотиков, способствуя росту полезных бактерий, включая представителей родов Bifidobacteria и Bacteroides [32] (показано цифрами 7 на Рис. 2). Кроме того, ОГМ замедляют развитие инфекций, вызываемых бактериями и вирусами, либо связываясь с патогеном в просвете кишечника, либо препятствуя связыванию с рецепторами гликанов на поверхности клеток [14–15, 22] (показано цифрами 8 на Рис. 2). Помимо этого, получаемые с пищей олигосахариды становятся частью выстилающего слоя кишечника, благодаря чему репертуар гликанов кишечника становится более разнообразным [33]. ОГМ также усиливают барьерную функцию эпителия, поддерживая рост of B. infantis в кишечнике младенцев [10, 18]. B. infantis продуцирует пептиды, которые, по данных эксперимента на мышах по моделированию колита, нормализуют проницаемость кишечника за счет усиления экспрессии белков, благодаря чему усиливается зона плотного контакта [34]. Есть вероятность, что ОГМ поддерживают другие бактериальные виды, которые важны для поддержания целостности кишечника. Эти изменения барьерной функции кишечника могут, в свою очередь, влиять на локальный и системный иммунитет [35]. ОГМ воздействуют на популяции иммунных клеток и секрецию цитокинов [22, 36] (показано цифрами 9 на Рис. 2). Некоторые ОГМ также поступают в кровоток [37–39] (показано цифрами 10 на Рис. 2), где вызывают системные эффекты, связывая моноциты, лимфоциты и нейтрофилы с клетками эндотелия [40] (показано цифрами 11 на Рис. 2) и формируя комплексы тромбоцитов и нейтрофилов [41] (показано цифрами 12 на Рис. 2). Для получения более подробной информации и детального рассмотрения этого вопроса рекомендуется ознакомиться с недавним обзором Кулинич и Лью (Kulinich, Liu [15]).

Углеводы и связывающие углеводы белки играют важную роль в иммунных реакциях. В клетках присутствуют уникальные гликановые сигнатуры, включающие сочетания определенных последовательностей гликанов, которые задействуются, когда клетки контактируют с другими клетками или другими компонентами окружающей среды [42, 43]. Однако многие из повторяющихся последовательностей гликанов, обнаруженных на клетках млекопитающих, найдены также на микроорганизмах и в продуктах питания, включая грудное молоко. Такое сходство создает возможности для взаимодействий организма-хозяина, микроорганизма и ОГМ.

Лектины (белки, связывающие углеводы) расположены на поверхности клеток млекопитающих, которые транслируют распознавание определенных повторов и обеспечивают пространственную презентацию указанных повторов за счет их активации. Лектины объединяются в соответствии с доменами распознавания углеводов (CRD) [42, 43].

Известно, по крайней мере, о десятке CRD, идентифицированных у млекопитающих, однако 3 класса лектинов, связанных с влиянием ОГМ на иммунные реакции,  это лектины C-типа, сиглексы (Ig-подобные лектины, связывающие сиаловую кислоту), а также галектины.

Для функционирования лектинов C-типа необходим кальций, к таким лектинам относятся селектины, лектин, связывающий маннозу, а также ассоциированная с мембраной молекула адгезии дендритных клеток (DC-SIGN). Рецепторы лектина C-типа на поверхности дендритных клеток (DC) определяют, будет ли клетка толерантной, или произойдет активация лимфоцитов [44]. DC-SIGN представляет особый интерес с точки зрения механизмов, посредством которых ОГМ могут влиять на иммунитет, из-за наличия CRD, специфичного для единиц фукозы. Более того, DC-SIGN экспрессируется клетками желудочнокишечного тракта у детей первого года жизни [45]. Эти клетки кишечника с большой вероятностью выполняют функции антигенпрезентирующих клеток, так как DC-SIGN экспрессируется антиген-презентирующими клетками, а именно DC [43]. Хотя взаимодействия между фукозилированными лигандами и DCSIGN вносят вклад в развитие иммунной толерантности, клеточная реакция в конечном итоге зависит от других реакций лиганда и рецептора, происходящих в то же время [43].

Сиглексы представляют собой лектины, связывающие сиаловую кислоту, наиболее часто они обнаруживаются в подгруппах иммунных клеток [46]. Существует, по крайней мере, 16 сиглексов, экспрессируемых разными популяциями лейкоцитов, куда относится сиалоадгезин (сиглек-1), CD22 (сиглек-2), миелинсвязанный гликопротеин (MAG, сиглек-4), сиглек-15, а также CD33- родственные сиглексы. Специфичность сиглексов определяется различиями во вторичных сайтах связывания [43]. Сиглексы являются рецепторами, расположенными на поверхности эндоцитов, которые обеспечивают перенос веществ между поверхностью клетки и внутриклеточными пузырьками; эти рецепторы, в основном, экспрессируются на клетках, участвующих в обработке и презентации антигенов [43]. Более того, молекулы, содержащие сиаловую кислоту, могут получить доступ к макрофагам за счет связывания с сиглексами на поверхности клеток [46]. На клетках млекопитающих некоторые гликаны, содержащие сиаловую кислоту, выполняют функции самостоятельных молекулярных паттернов и останавливают иммунные реакции на непатогенные стимулы. Связывание определенных сиглексов стимулирует образование иммунорегулирующего цитокина интерлейкина (IL)-10 [47]. Галектины важны для обновления клеток и регуляции работы иммунной системы. CRD галектинов специфичен для βгалактозидаз. Когда клетки десиалированы, плотность открытых остатков галактозы на поверхности клеток увеличивается. Например, наивные T клетки экспрессируют CD45 с α-2,6- связанной сиаловой кислотой. Количество α-2,6-связанной сиаловой кислоты сокращается после активации T-клеток. Уменьшение количества α-2,6-связанной сиаловой кислоты делает активированные T клетки восприимчивыми к галектин-1- опосредованному апоптозу [48]. Таким образом, связывание сиалированных ОГМ с клетками может препятствовать апоптозу.

Для определения влияния ОГМ на экспрессию гена, связанного с иммунитетом и выработкой белка, использовали линии клеток кишечника. Эти клетки инкубировались совместно с олигосахаридами [28], бактериями [48] или липополисахаридами (LPS) для моделирования бактериальной инфекции [29]. Совместное инкубирование Bifidobacterium с линией кишечных клеток Caco-2 и ОГМ приводило к регуляции на понижение генов клеток кишечника, связанных с активностью хемокинов, по сравнению с совместным инкубированием с глюкозой или лактозой [29]. С другой стороны, при отсутствии бактериального ко-стимулирования, ОГМ повышали экспрессию нескольких хемокинов в клеточной линии HT-29 [28]. Дополнительные исследования на линиях кишечных клеток T84 и HCT8 показали, что сложные смеси ОГМ, а также 2’ FL, снижали встречаемость сигнатур воспаления кишечника [29].

Было установлено, что ОГМ влияют на течение вирусной желудочно-кишечной инфекции. При моделировании острой ротавирусной инфекции (RV) в условиях изолирования подвздошной кишки 21-дневного поросенка in situ, петли кишечника, обрабатываемые одновременно ОГМ и RV, имели сниженный уровень экспрессии мРНК неструктурного белка-4 (NSP-4). Это показывает, что ОГМ могут снижать репликацию RV [49]. Однако при этом не было отмечено изменения экспрессии кишечного цитокина и хемокина. Как нейтральные, так и кислые ОГМ, снижали экспрессию мРНК кишечного NSP4 в модельном эксперименте in situ, тогда как только кислые ОГМ эффективно уменьшали инфицирующий потенциал RV в эксперименте in vitro [49].

ОГМ выявляются в плазме детей первого года жизни, получающих грудное молоко в концентрациях 1–133 мг/л [37, 39], это указывает на вероятность того, что получаемые с пищей ОГМ могут непосредственно воздействовать на иммунные клетки, циркулирующие в крови. Как указывалось ранее, многие иммунные рецепторы распознают олигосахаридные структуры соответствующих гликопротеиновых лигандов [14, 15]. Поскольку подгруппа ОГМ является структурно сходной с лигандами селектинов [14], есть вероятность, что ОГМ могут связываться непосредственно с иммунными клетками и запускать передачу сигналов, что приводит к изменению популяций и функций иммунных клеток. Например, P- и E-селектины распознают сиалил-Льюис x (sLeX), гликановый фрагмент нескольких ОГМ [11]. Кроме того, фукозилирование и сиалирование, 2 ферментные модификации, часто встречающиеся у ОГМ, обеспечивают возможность связывания с селектинами [50]. Индуцированное ОГМ разрушение взаимодействия иммунного белка-углевода снижает перемещение нейтрофила [40] и его активацию [41]. По данным экспериментов ex vivo на мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) от новорожденных поросят, ОГМ непосредственно влияют на пролиферацию иммунных клеток и образование цитокинов [36]. Стимулирование изолированными ОГМ увеличивало выработку регуляторного цитокина IL-10 [36]. В соответствии с другими наблюдениями, кислые ОГМ индуцируют образование IL-10; кроме того, было установлено, что кислые ОГМ индуцируют IFN-γ в эксперименте ex vivo на стимулированных мононуклеарных клетках крови из пуповины человека [45]. Выделенные ОГМ усиливали пролиферацию PBMC после стимуляции митогеном T-клеток, фитогемагглютинином (PHA). Кроме того, сиалированные ОГМ усиливали пролиферацию PBMC, стимулированных митогеном B-клеток LPS [36]. Напротив, 2’ FL ингибировали пролиферацию нестимулированных PBMC, культивируемых в течение 3 дней. Таким образом, ответная реакция на ОГМ может зависеть от состояния ребенка первого года жизни. При состоянии отсутствия стимуляции ОГМ замедляют пролиферацию, в то же время усиливая ее в ответ на митогенные стимулы ОГМ.

Кроме того, секреция цитокинов PBMC от детей, находящихся на грудном вскармливании, а также детей, получающих любую формулу для искусственного вскармливания, содержащую 2’ FL, простимулированных ex vivo респираторным синцитиальным вирусом, была сходной, при этом секретировалось меньшее количество фактора некроза опухоли-α и интерферона-γ, отмечалась тенденция к образованию меньшего количества IL1Ra, IL-6, а также IL-1β, чем в клетках от детей, получавших контрольную формулу для искусственного вскармливания [53].

В другом проведенном недавно исследовании по изучению детей оценивался эффект формулы для искусственного вскармливания, обогащенной 2’ FL (1.0 г/л) и LNnT (0.5 г/л), по сравнению с необогащенной формулой. Дети получали формулу для искусственного вскармливания с 14 дней до возраста 6 месяцев, после чего их переводили на стандартную формулу для последующего кормления, дети находились под наблюдением до достижения возраста 12 месяцев. Дети, получавшие обогащенную ОГМ формулу для искусственного вскармливания, значительно реже фигурировали в отчетах родителей (p = 0.004–0.047), в связи с такими событиями как бронхит в течение периода до 4 месяцев (2.3 по сравнению с 12.6%), 6 месяцев (6.8 по сравнению с 21.8%), а также 12 месяцев (10.2 по сравнению с 27.6%); у таких детей регистрировалось меньшее количество инфекций нижних дыхательных путей (кластер AE) в течение периода до 12 месяцев (19.3 по сравнению с 34.5%); было зафиксировано более редкое использование жаропонижающих препаратов в течение периода до 4 месяцев (15.9 по сравнению с 29.9%); и меньшая частота лечения антибиотиками в течение периода до 6 месяцев (34.1 по сравнению с 49.4%) и 12 месяцев (42.0 по сравнению с 60.9%), чем у детей, получавших стандартную формулу для искусственного вскармливания [54].

Результаты нескольких исследований на животных подтверждают уменьшение встречаемости инфекций у детей, получавших формулу для искусственного вскармливания с ОГМ. У мышей, инфицированных Escherichia coli, пероральное принудительное кормление один раз в день ежедневно 100 мг, 2’ FL препятствовало снижению веса тела и уменьшало колонизацию кишечника адгерентно-инвазивной E. coli, воспаление кишечника, экспрессию в клетках крипт CD14, а также IL-6, IL-17, образование фактора некроза опухоли-α в ответ на инфицирование организма адгерентно-инвазивной E. coli по сравнению с мышами, которых лечили веществом, используемым в качестве средства доставки [29]. Мыши, получавшие при кормлении 2’ FL и подвергнутые илеоцекальной резекции, имели более высокие показатели прироста веса, у них отмечался больший показатель глубины крипт и высоты ворсинок в месте иссечения, чем у мышей, которым не давали добавок [30]. Кроме того, у мышей, которым давали 2’ FL, отмечалась регуляция на повышение генов иммунной реакции слизистой дистального отдела тонкого кишечника [30]. Исследования, в которых поросятам и детям давали ОГМ, были сосредоточены на изучении 2’ FL, которую можно приобрести в больших количествах по приемлемым ценам, а также фукозилированных олигосахаридов, которые, как было показано, служат пищей для специфических полезных бактерий в течение событий, связанных с воспалением кишечника [56]. Учитывая то, что известно об эффектах других ОГМ, они также должны быть изучены в нутрициологических исследованиях, когда будут доступны в достаточных количествах.

Только в 1 исследовании in vivo использовалась сложная смесь ОГМ и оценивались исходы для работы иммунной системы. Согласно этому отчету, новорожденные поросята получали рацион, содержащий 4 г/л ОГМ, в состав смеси входили 40% 2’ FL, 10% 6’-сиалиллактозы (6’ SL), 35% лакто-N-неотетраозы (LNnT), 5%, 3‘-сиалиллактозы (3’ SL), а также 10% свободной сиаловой кислоты. У поросят отмечалось снижение длительности диареи, в ответ на инфицирование RV до 48.8 ± 9.8 ч по сравнению с 80.6 ± 4.5 ч у поросят, получавших необогащенную формулу для искусственного вскармливания [22]. Ткани подвздошной кишки, взятые от поросят, которых кормили ОГМ, содержали больше мРНК IFN-γ (производимых Th1 клетками) и IL-10 (противовоспалительного цитокина), по сравнению с поросятами, получавшими формулу для искусственного вскармливания [22].

В эксперименте на мышах с моделированием пищевой аллергии, 2’ FL и 6’ SL, применяемые при помощи перорального принудительного кормления, снижали интенсивность симптомов у мышей, сенсибилизированных к яичному белку овальбумину [51]. В частности, простимулированные овальбумином спленоциты, полученные от мышей, пролеченных 6’SL, производили больше IL-10 и меньше IFN-γ, чем клетки, взятые от мышей, не подвергавшихся лечению. Более того, мыши, пролеченные 2’ FL- или 6’ SL, имели больше регулирующих иммунных клеток в иммунных тканях кишечника, чем непролеченные мыши. Интересно отметить, что ни 2’ FL, ни 6’SL, не влияли на T регулирующие клетки кишечника при применении у несенсибилизированных мышей [51]. Это подчеркивает необходимость выбора соответствующей модели провокационной пробы для оценки воздействия веществ, получаемых с пищей, на иммунную систему. У мышей олигосахариды молока LNFP III и LNnT способствуют реакциям, опосредованным Th2, и подавляют реакции с участием Th1 [57]. Недавно было показано, что дети, получающие грудное молоко с низкими концентрациями LNFP III (<60 мкM ) имели в 6.7 раз более высокую вероятность (95% ДИ 2.0–22) развития аллергии на коровье молоко по сравнению с детьми, получающими молоко с высокими концентрациями LNFP III [58].

При использовании другого подхода, основанного на изучении мышей knockout, было показано, что SL-содержащие вещества могут оказывать непосредственное воздействие на иммунитет слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта [52, 59]. В одном исследовании наличие 3’SL в молоке увеличивало количество иммунных клеток, инфильтрующихся в кишечнике у мышей без IL-10 [52]. Более того, обогащение 3’SL увеличивало степень тяжести колита у новорожденных мышей без IL-10 и St3gal4 (фермент, синтезирующий 3’SL), при этом пересаживание мышат дикого типа к дефицитным самкам снижало степень тяжести колита. Одной из особенностей данной работы является то, что исследование проводилось в отсутствие эндогенной выработки IL-10, тогда как в других исследованиях in vivo было показано, что некоторые ОГМ увеличивают количество IL-10 в кишечнике [22, 51]. 3’ SL является продуктом нескольких патогенных бактерий [60], при этом данные, полученные при исследовании патогенных бактерий и грудного молока, сходны (связь α2,3 между сиаловой кислотой и галактозой). 3’ SL распознается DC и генерирует иммунную ответную реакцию посредством передачи сигнала через каскад TLR4 [61]. Эти результаты позволяют предположить, что присутствие 3’ SL увеличивает воспалительную ответную реакцию посредством прямого воздействия на DC. При отсутствии TLR4 3’ SL была менее эффективной для индукции активации DC. Однако DC также демонстрировали минимальное увеличение экспрессии CD40. Это указывает на то, что для DC характерен, по крайней мере, еще один механизм распознавания 3’ SL, хотя и гораздо менее эффективный, чем путь TLR4. TLR4 является рецептором для LPS E. coli. Еще одна связь между 3’ SL и TLR4 описывается в более поздней работе, где было показано, что 3’ SL стимулирует пролиферацию популяции E. coli в кишечнике, и что избыточный рост E. coli является причиной обострения колита, вызванного декстран сульфатом натрия за счет высвобождения провоспалительных цитокинов из кишечных DC [62]. Эти примеры показывают сложность связей между олигосахаридами, бактериями кишечника и иммунной системой.

Богатое разнообразие ОГМ создает условия для модулирования как врожденного, так и адаптивного иммунитета новорожденных. Данные экспериментов in vitro и исследований на животных показывают, что ОГМ непосредственно взаимодействуют с желудочно-кишечными эпителиальными клетками, а также с клетками иммунитета слизистой оболочки и общей иммунной системы, изменяя иммунные реакции. ОГМ оказывают полезное воздействие, формируя микробиом ребенка, находящегося на грудном вскармливании.

Коммерческая доступность ОГМ, а также увеличение объемов данных исследований, показывающих, что формулы для искусственного вскармливания, обогащенные ОГМ, безопасны и обладают потенциально полезным воздействием на организм детей, привели к тому, что недавно в формулы для искусственного вскармливания начали добавлять 2’ FL изолированно или в сочетании с LNnT. Кроме того, учитывая положительное влияние на работу иммунной системы и защитные системы организма ребенка, ОГМ также могут быть полезны для других популяционных групп, например, в случаях нарушения работы иммунитета, или в условиях высокого риска развития инфекций.

Было проведено лишь небольшое количество исследований, где животным или детям давали ОГМ. Кроме того, в нескольких работах были оценены эффекты применения сложных смесей ОГМ с точки зрения реакций иммунной системы. Таким образом, необходимо проведение исследований, в которых удалось бы точно описать механизмы обнаруженных явлений и полностью реализовать потенциал ОГМ, связанный с полезными воздействиями на иммунные функции в организме ребенка первого года жизни.

Шарон Донован получила грант на исследования от Отдела научных исследований и разработок Института питания Нестле. Сара Комсток заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Олигосахариды грудного молока (ОГМ): факторы, влияющие на их состав и физиологические функции

Норберт Спренгер

Институт нутрициологии¹, Институт продовольственной безопасности и аналитических исследований, Отделение научных исследований Нестле Лозанна, Швейцария. ²

Серия семинаров Института питания Нестле, том 90, стр. 43-56, 2019.

Олигосахариды грудного молока (ОГМ) представляют собой молекулы, возникающие в результате удлинения молочного сахара лактозы за счет присоединения галактозы, Nацетилглюкозамина, фукозы и сиаловой кислоты. Состав ОГМ в грудном молоке в значительной степени зависит от полиморфизма фукозилтрансфераз FUT2 и FUT3 в организме матери, а также от стадии лактации. Данные клинических наблюдательных исследований по изучению пар «мать-ребенок первого года жизни, получающий грудное вскармливание» позволяют связать определенные ОГМ с микробиотой кишечника ребенка, заболеваемостью, инфекционной диареей и аллергическими реакциями. Данные наблюдательных и базовых исследований указывают на то, что ОГМ влияют на формирование первичной микробиоты и развитие иммунитета слизистой, а также препятствуют активности патогенов, тем самым обеспечивая дополнительную защиту от инфекций. Клинические интервенциональные исследования по изучению формул для искусственного вскармливания, обогащенных определенными ОГМ, например, 2’-фукозиллактозой (2’FL), или двумя ОГМ, 2’FL и лакто-N-неотетраозой (LNnT), показало, что они оптимизируют рост в соответствии с возрастом ребенка и переносятся хорошо. Показатели, на основании которых оценивали результативность применения формул, устанавливали до начала исследования, при этом было показано, что существует корреляция между кормлением ребенка первого года жизни формулой для искусственного вскармливания с 2 ОГМ и уменьшением количества сообщений о заболеваниях нижних дыхательных путей наряду со снижением потребности в антибиотиках в течение первого года жизни, по сравнению с кормлением контрольной формулой. Одновременно с этим состав микробиоты в раннем периоде жизни видоизменялся в направлении показателей детей, находящихся на грудном вскармливании. На основании совокупности полученных данных можно предположить, что ОГМ могут влиять на иммунную защиту посредством воздействия на микробиоту кишечника в раннем периоде жизни. Эти данные ставят на повестку дня необходимость проведения дальнейших клинических исследований, чтобы углубить наше понимание биологии ОГМ и оценить степень их значимости для питания ребенка.

Что из себя представляют олигосахариды грудного молока (ОГМ)? В чем их значение для питания ребенка первого года жизни? Эти вопросы в равной степени интересуют ученых и педиатров в течение более чем ста лет. Усовершенствования методов анализа, а также достижения последних лет в технологии синтеза веществ в больших объемах привели к значительному прогрессу в данной области исследований. Все эти новшества обеспечили получение материалов и методов, которые позволили подробно изучить ОГМ и точно измерить количество, а также определить их качественные характеристики. Кроме того, были проведены базовые исследования ОГМ, исследования с моделированием разных ситуаций, а также клинические наблюдательные и интервенциональные исследования.

«Один ОГМ не то же самое, что другой ОГМ”, это значит, что определенные олигосахариды грудного молока не идентичны друг другу, особенно, когда речь идет о взаимосвязи структуры и функции. В химическом отношении ОГМ представляют собой молекулы, возникшие при удлинении молочного сахара лактозы в разных положениях связей одним моносахаридом или сочетанием моносахаридов, такими как L-фукоза (Fuc), Dгалактоза (Gal), N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc) и Nацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота, SA). Gal и GlcNAc обычно удлиняют лактозу в виде дисахарида Gal-GlcNAc. Многочисленные и разнообразные ОГМ могут быть подразделены на категории с учетом специфических структурных особенностей, связанных с активностью разных гликозилтрансфераз, участвующих в их синтезе. Однако, многие ОГМ сочетают разные структурные черты.

Грудное молоко, рекомендуемое и естественное питание для детей, приспособленное для их нужд природой, ассоциируется со снижением риска инфекционных заболеваний, а также, возможно, диабета и избыточного веса, в то время как ситуация с аллергическими реакциями менее ясна [1]. Это позволяет предположить, что специфичные для грудного молока компоненты, такие как ОГМ и другие биоактивные молекулы, могут обеспечивать указанные полезные эффекты.

ОГМ обладают структурным сходством с гликанами слизистой и не перевариваются в желудочно-кишечном тракте. По этой причине они, как и предполагалось ранее, способны оказывать воздействие на многочисленные опосредованные гликанами процессы, такие как колонизация первичной микробиоты и инфекционная активность патогенов (Рисунок 1A). На основании данных клинических наблюдательных и базовых исследований можно утверждать, что ОГМ, функции которых зависят от структуры, способствуют (i) формированию адаптированного микробиома слизистой, (ii) обеспечивают повышение сопротивляемости организма воздействию патогенов и (iii) определяют защитные свойства кишечного барьера и иммунитета, тем самым определяя уровень иммунной защиты.

В данной работе кратко рассматриваются генетические и экологические факторы, влияющие на состав ОГМ грудного молока, физиологическая роль ОГМ, в соответствии с данными клинических наблюдательных исследований, доклинических исследований по изучению способа действия, а также обсуждаются выводы клинических интервенциональных исследований.

ОГМ напоминают антигены группы крови и сиалированные гликаны, присутствующие во внешнем слое слизистой. В целом, одни и те же гликозилтрансферазы участвуют в синтезе гликанов клеток слизистых и ОГМ, которые образуются в молочной железе. Фукозилтрансферазы FUT2 (ген «Секретор») и FUT3 (ген Льюиса) описаны более подробно, так как они характеризуются естественным полиморфизмом в организме человека [2] (Рисунок 2A). Специфические полиморфные изменения выключают их ферментную активность.

Таким образом, можно выделить специфические структуры ОГМ, которые зависят от FUT2 или FUT3. Все зависимые от FUT2 ОГМ содержат присоединенную в положении альфа-1,2 фукозу, например 2’FL, лактодифукозиллактоза (LDFT), лакто-Nфукозилпентоза-I (LNFP-I). Интересно отметить, что следовые количества 2’FL были обнаружены в грудном молоке, предположительно, FUT2-отрицательных матерей в азиатских популяциях [3, 4]. Это показывает, что природа этого инактивирующего полиморфизма и, следовательно, профиля ОГМ, может коррелировать с особенностями популяции [5]. Типичными FUT3-зависимыми ОГМ являются LNFP-II, лакто-Nдифукозилгексоза-I (LNDFH-I), содержащая альфа-1,4-связанную фукозу, а также, в меньшей степени, 3-фукозиллактоза (3FL) и LDFT, содержащие альфа-1,3-связанную фукозу. В грудном молоке, не содержащем выявляемых количеств LNFP-II, обнаружены более низкие концентрации ОГМ с альфа-1,3 фукозой на глюкозе и повышенные количества ОГМ с альфа-1,3 фукозой на GlcNAc. Следовательно, другой фермент FUT (например FUT4, 5, 6, 7 или 9) также участвует в образовании ОГМ с альфа-1,3-связанной фукозой на GlcNAc и глюкозе.

Отсутствие функционального фермента FUT2 (или FUT2 и FUT3) влияет на общую концентрацию ОГМ в молоке, если выразить это количество в виде суммы количественных показателей содержания всех ОГМ [2] (Рисунок 2). В то время как количество некоторых ОГМ увеличивается при отсутствии активного фермента FUT2 (например LNT, 3FL), при отсутствии фукозилирования могут образовываться другие более крупные молекулы нефукозилированных ОГМ.

На сегодняшний день отсутствует описание общих тенденций генетического полиморфизма сиалированных ОГМ. Это показывает, что, если инактивирующий полиморфизм генов сиалилтрансферазы существует, это достаточно редкое явление. По данным экспериментов на мышах сиалилтрансферазы ST6Gal1 и ST3Gal4 участвуют в синтезе 6’-сиалиллактозы (6’SL) и 3’- сиалиллактозы (3’SL), соответственно, кроме того, другая сиалилтрансфераза, возможно ST3Gal1, также участвует в образовании 3’SL [6]. Механизмом, также влияющим на состав ОГМ, возможно, является доступность субстрата донора и акцептора, о чем свидетельствует увеличение содержания 3FL, когда снижается концентрация 2’FL, основного фукозилированного ОГМ [3]. Интересно отметить, что концентрации ОГМ меняются в течение периода лактации, при этом разные ОГМ характеризуются разной динамикой [3]. Концентрации таких ОГМ как 6’SL или LNT уменьшаются быстрее в течение первых недель лактации, в то время как концентрации 2’FL и 3’SL снижаются медленнее в течение более длительного периода времени, а количество других ОГМ, таких как 3FL, увеличивается на протяжении периода лактации (Рисунок 2B).

Такие изменения состава, обусловленные генетической природой организма матери и стадией лактации, могут поставить под сомнение результаты наблюдений относительно связи ОГМ с клиническими показателями детей, находящихся на грудном вскармливании, и, следовательно, требуют дополнительного изучения.

Концентрации ОГМ в молозиве, переходном и зрелом молоке, по всей видимости, не отличаются у матерей, которые родили недоношенных детей (n=18; гестационный возраст <37 недель) и доношенных детей (n=14; гестационный возраст ≥37 недель) [2]. Кроме того, было отмечено, что концентрации фукозилированных и сиалированных ОГМ были сходными в молоке, которое вырабатывается после преждевременных и срочных родов, хотя для молока, которое образуется после преждевременных родов, по всей видимости, характерна большая степень вариабельности по экспрессии фукозилированных ОГМ [7].

На сегодняшний день нам неизвестно, действительно ли рацион питания матери влияет на состав ОГМ, и каким образом это происходит. В проведенном недавно в Гамбии (Африка) наблюдательном исследовании с участием 33 матерей и их детей, получавших грудное вскармливание, было обнаружено значительно более высокое содержание ОГМ в молоке на 20 неделе лактации в сухой сезон (n=21) по сравнению с сезоном дождей (n=12) [8].

Авторы высказали гипотезу о возможной связи с более высоким потреблением энергии в течение сезона засухи. В двух других исследованиях, проведенных в Малави (Африка) по изучению в когортах пар «мать-ребенок» (n=88 и n=215) было установлено, что общее количество ОГМ, а также сиалированных и фукозилированных ОГМ, было меньше через 6 месяцев после родов в грудном молоке матерей, дети которых страдали от тяжелой формы низкорослости, по сравнению с детьми, имеющими нормальный размер [9]. Эти исследования позволяют предположить, что питание и здоровье матери могут влиять на состав ОГМ.

По аналогии, более высокий индекс массы тела матери и прирост веса в течение беременности, обычно отражающие изменение метаболизма, могут влиять на состав ОГМ. Исследования этого вопроса в настоящее время продолжаются [10] (Binia et al. 2017 Резюме FASEB SRC). Необходимы соответствующим образом спланированные исследования для изучения возможных изменений состава ОГМ в контексте потребления матерью энергии в целом и специфических нутриентов, в частности.

Состав ОГМ связан с формированием микробиоты кишечника у детей первого года жизни.

Первичный микробиом оказывает серьезное влияние на развивающуюся иммуннитет, будучи при этом самостоятельной системой, обеспечивающей устойчивость к колонизации организма патогенами. Интересно отметить, что формирование микробиоты кишечника также способствует, посредством врожденного опосредованного лимфоидными клетками процесса, улучшению защиты против респираторных инфекций [11]. При проведении первых исследований по изучению грудного молока и грудного вскармливания была отмечена значимая корреляция между грудным вскармливанием и иммунной защитой от инфекционных заболеваний, а также соответствующими показателями смертности. Было установлено, что у детей, находящихся на грудном вскармливании, в первичной микробиоте кишечника доминируют бифидобактерии, которые отсутствовали в формулах для искусственного вскармливания, кроме того, бифидогенный фактор, характерный для грудного молока, был выявлен во фракции ОГМ грудного молока [12].

Из исследований первичной микробиоты нам известно, что бифидобактерии могут использовать разные ОГМ и способны расти на них, причем выявлена определенная специфичность для разных штаммов [13, 14]. В нескольких исследованиях наблюдалось увеличение бактериальной метаболической активности при росте на ОГМ, примером чего являлось образование ацетата короткоцепочечных жирных кислот [15, 16]. Примечательно, что многочисленные потенциально патогенные бактерии из группы Enterobacteriaceae не росли на отдельных ОГМ, и не использовали отдельные ОГМ как источник углерода [17], в то время как рост других патогенов, например, Streptococcus agalactiae (группа B Streptococcus, GBS) замедлялся в присутствии ОГМ [18, 19].

Недавно было показано, что LNnT в грудном молоке коррелируют с количеством Bifidobacterium longum ssp infantis [8]. В эксперименте с гнотобиотическими мышами, в организме которых присутствует только Bacteroides и вид B. longum ssp infantis, использование LNnT приводило к доминированию бифидобактерий, хотя оба вида бактерий могли использовать LNnT in vitro [20]. В эксперименте с гнотобиотическими мышами, которым были пересажены семь микроорганизмов из организма человека, также отмечалось преобладание B. longum ssp infantis, когда этих мышей кормили 2’FL в сочетании с LNnT, по сравнению с применением только LNT (Sprenger N. et al. неопубликованные данные наблюдений), хотя B. longum ssp infantis может расти на многих разных ОГМ, включая LNT, в качестве субстрата [13].

Геномный и гликомный анализ у детей первого года жизни позволил получить дополнительные доказательства роли ОГМ в формировании первичного микробиома, при этом были выявлены связи между отдельными ОГМ и определенными родами бактерий в пробах фекалий [21-23]. Бифидобактерии, которые доминировали в микробиоте кишечника детей, находящихся на грудном вскармливании (n=105) в возрасте 4 месяцев, ассоциировались с содержанием в грудном молоке FUT2-ОГМ [24]. Статус ребенка по содержанию FUT2 и возможные связанные с этим влияния на профиль микробиоты не были оценены, несмотря на то, что ранее были получены данные, свидетельствовавшие о том, что статус по содержанию FUT2 сам по себе может влиять на микробиоту кишечника, по крайней мере, у взрослых [25]. В другой когорте анализ относительно небольшой подгруппы 4-месячных детей, находящихся на исключительно грудном вскармливании (n=14), выявил связь между положительным статусом матери по наличию FUT2 и более высоким содержанием бифидобактерий до возраста ребенка 2-3 лет [26]. Однако в другом недавно проведенном исследовании с участием 33 матерей и их детей в Гамбии не сообщалось о статистически значимых влияниях ОГМ на общий сдвиг профиля в сторону бифидобактерий [8], в то время как количество отдельных бифидобактерий, таких как B. longum ssp infantis, коррелировало с концентрациями LNnT в грудном молоке, как было показано ранее. Эти первые отчеты выявили необходимость более масштабных наблюдательных исследований аналогичного дизайна, включая подробный анализ ОГМ в грудном молоке и фенотип ребенка первого года жизни по FUT2, чтобы можно было получить более подробные сведения и лучше понять характер связи между ОГМ и составом микробиома кишечника ребенка.

На сегодняшний день клинические наблюдательные исследования в сочетании с базовыми исследованиями позволяют предположить, что FUT2-ОГМ, такие как 2’FL и LNFP-I, а может и другие ОГМ, не зависимые от FUT2, например, LNnT, участвуют в формировании первичной микробиоты кишечника с доминированием бифидобактерий. Исследования in vitro помогают оценить связанные с ОГМ метаболические возможности микроорганизмов и специфические свойства штаммов, в то время как наблюдательные исследования на животных и исследования с участием человека показывают, что взаимодействие между бактериями и слизистой кишечника отражает более сложную картину. Следовательно, фокусируя внимание на здоровье ребенка первого года жизни, главная задача заключается в том, чтобы лучше понять влияние ОГМ на динамику развития микробиома в естественной экосистеме, используя холистический и ориентированный на экологию подход.

Было проведено изучение ОГМ в связи с встречаемостью инфекционной диареи в когорте мексиканских матерей и детей (n=93) [27, 28]. Более высокие концентрации в грудноммолоке α1- 2 фукозилированных ОГМ ассоциировались с более низкими показателями встречаемости всех случаев диареи средней степени тяжести и тяжелой степени. Наиболее часто выявляемой причиной диареи в данной когорте была Campylobacter jejuni, следующее место занимали инфекции, вызываемые калицивирусом и энтеропатогенными Escherichia coli. В частности, более высокие концентрации 2’FL и LNFP-I в грудном молоке коррелировали с более низкими показателями встречаемости диареи, вызванной C. jejuni и калицивирусом, соответственно. Эти наблюдения в течение периода грудного вскармливания не соответствовали картине, обнаруженной в периоде после завершения грудного вскармливания, что указывает на возможный временный эффект ОГМ по обеспечению защиты от инфекционной диареи. Это соответствует представлениям об их предположительной роли как веществ, способных препятствовать адгезии патогенов. Экспериментальные данные доклинических исследований с моделированием инфекций также демонстрируют защитные эффекты 2’FL от C. jejuni [29] и скопления инвазивной E. coli [30]. Исходя из этих данных, 2’FL и другие FUT2-ОГМ, по всей видимости, действуют как растворимые лиганды, блокирующие C. jejuni от прикрепления к эпителиальным клеткам кишечника, в то время как защита от E. coli, может реализовываться посредством противовоспалительного воздействия, возможно, в сочетании с изменением состава микробиоты кишечника.

Гликаны, содержащие α1-2-связанную фукозу, экспрессируемые на эпителиальных клетках FUT2-положительных детей, могут играть роль рецепторов для связывания патогена, что коррелирует с риском специфических инфекционных заболеваний в указанной популяции [31]. Генетические исследования показали, что дети первого года жизни и дети более старшего возраста с нефункциональным геном FUT2 имеют штамм-специфическую защиту против норовируса и ротавируса [32, 33]. Восприимчивость к определенным штаммам ротавируса зависит как от статуса по FUT2, так и FUT3 [34]. В экспериментальном отношении инфекционный потенциал некоторых штаммов ротавируса был снижен в присутствии FUT2 ОГМ 2’FL, в то время как другие штаммы вируса реагировали на воздействие сиалированных ОГМ, а именно 3’SL и 6’SL [35]. Аналогичным образом, 2’FL также связывались со специфическими штаммами норовируса [36].

Недавно было установлено, что, помимо блокирования присоединения патогена к слизистой организма ребенка, ОГМ замедляют рост патогенных бактерий Streptococcus группы B (GBS) [18, 19, 37], которые являются основной причиной сепсиса у недоношенных детей. Рост GBS специфически ингибировался в присутствии LNT и LNFP-I, в то время как сиалированные ОГМ или галактоолигосахариды (GOS) не оказывали никакого влияния [19]. Экспериментальные данные указывают, что, предположительно, причиной может быть активность гликозилтрансферазы GBS [19]. Возможно, речь идет о сходном механизме. Как было показано, ОГМ из молока FUT2-отрицательных матерей обладают бактериостатическими свойствами, которые реализуются через изменение образования биопленки [18]. В наблюдательном исследовании, проведенном в Гамбии, где были изучены 183 пары «ребенок первого года жизни-мать», было отмечено, что FUT3-положительные матери с меньшей степенью вероятности являлись носителями GBS, как и их дети с рождения [37]. Интересно отметить, что дети FUT3-положительных матерей также с большей степенью вероятности освобождались от колонизации GBS с рождения до возраста 2-3 месяцев по сравнению с детьми FUT3-отрицательных матерей.

В пилотном исследовании с участием 49 пар «мать-ребенок первого года жизни», более высокие концентрации в грудном молоке FUT3-ОГМ LNFP-II на 2 неделе после родов ассоциировались с более низким риском респираторных и желудочно-кишечных заболеваний на 6 и 12 неделе жизни ребенка [38]. Эта связь утрачивала значимость после завершения грудного вскармливания. Аналогичным образом, в когортном исследовании в Замбии у 143 неинфицированных детей, контактировавших с ВИЧ, более высокие концентрации фукозилированных ОГМ в грудном молоке в возрасте 1 месяца после родов были связаны более низким риском смертности до возраста 2 лет [39]. В другом небольшом исследовании с выделением когорт, проведенном в Гамбии, по изучению пар «мать-ребенок первого года жизни» (n=33), более высокие относительные концентрации в грудном молоке фукозилированных ОГМ (общее количество LNFP-I и LNFP-III) и сопутствующее более низкое относительное количество LNT ассоциировалось с более низким риском заболевания до достижения возраста 4 месяцев [8].

Что касается респираторных патогенов, непосредственное воздействие ОГМ, по всей видимости, менее очевидно и, таким образом, предположительно связанное с ОГМ защитное действие может быть опосредовано микробиомом кишечника [11, 40]. Тем не менее, в эксперименте, непосредственный контакт Streptococcus pneumoniae с LNnT и сиалил-LNnT, а также последующее инфицирование, эффективно блокировали колонизацию легких этим микроорганизмом в эксперименте на кроликах [41]. В эксперименте на клетках LNnT и 2’FL дозозависимо снижали концентрации вируса гриппа и респираторного синцитиального вируса (RSV) в клетках воздухоносных путей [42].

Наблюдательные исследования наряду с фактами, выявленными в доклинических экспериментах с моделированием различных заболеваний, позволили впервые доказать связь между ОГМ и риском инфекций, главным образом, при наличии специфической связи структуры и функции. Механически ОГМ могут оказывать воздействие посредством разных функций, хотя доклинические исследования подчеркивают наличие особых уникальных свойств. Современные исследования также очерчивают направления, которые необходимо изучить в будущем в ходе наблюдательных исследований, а именно: время получения проб молока и потребления грудного молока, этиологию инфекций, количественный анализ ОГМ по сравнению с категориальным и, наконец, генетику организма матери и ребенка первого года жизни.

На аллергические реакции влияют многочисленные экологические (включая питание), а также генетические факторы. К ним, в том числе, относятся разные биологически активные вещества грудного молока и, возможно, ОГМ. В исследовании в Финляндии с выделением когорт по изучению 266 пар «мать ребенок первого года жизни» оценивался риск наследственной аллергии, при этом концентрации 2’FL в первом грудном молоке, ассоциировались с более низким риском проявления IgEопосредованной экземы в возрасте 2 лет только у детей, рожденных при помощи кесарева сечения [43]. Это наблюдение указывает на то, что 2’FL могут влиять на IgE-опосредованную экзему посредством изменения первичной микробиоты кишечника, которая, как известно, отличается у детей, рожденных при помощи кесарева сечения, и детей, которые были рождены вагинальным способом. Возможная связь ОГМ с аллергией на коровье молоко (CMA) изучалась в другом исследовании с выделением когорт, где участвовало 39 женщин с детьми, у которых появились признаки CMA к возрасту 18 месяцев, а также 41 женщина с детьми без CMA [44]. Была выявлена связь между концентрацией в молоке нескольких отдельных ОГМ (LNFP-III, 6’SL, LNFP-I, DSLNT) и сочетаний ОГМ со сниженным риском CMA, при этом наиболее заметная корреляция была выявлена для LNFP-III. Забор проб грудного молока варьировал в течение первых 6 месяцев после родов и, следовательно, этот фактор мог стать причиной неточностей, так как концентрации ОГМ в значительной степени меняются в течение указанного периода. Что касается механического аспекта, авторы выдвинули гипотезу, что LNFP-III могут воздействовать на иммунную систему через дендритные клетки и DC-SIGN. В доклиническом исследовании по моделированию пищевой аллергии были изучены 2’FL и 6’SL, оба ОГМ снижали интенсивность симптомов, проявление которых было связано с активностью тучных клеток [45].

Наблюдательные исследования, проведенные до настоящего времени, имеют недостатки, однако позволяют получить предварительное представление о возможных связях между специфическими ОГМ и риском аллергических реакций. Для оценки реальности такой связи необходимо проведение повторных более масштабных исследований с выделением когорт и гармонизированной процедурой получения проб молока, стратификацией по способу родоразрешения и оценкой генотипа ребенка первого года жизни в отношении активности FUT2 и FUT3.

Недавний прогресс в индустриальной биотехнологии позволил получать в достаточных количествах некоторые ОГМ, а именно 2’FL и LNnT. Доклинические токсикологические тесты позволили установить их безопасность, в результате было разрешено применение этих ОГМ в качестве новых продуктов питания в Европейском Союзе. Данные вещества также были признаны в целом безопасными в США.

У взрослых, как 2’FL, так и LNnT изучались изолированно или в сочетании в разных дозах от 5 до 20 г/день в слепом рандомизированном исследовании, проведенном под контролем плацебо (n=100). Оба ОГМ переносились хорошо и способствовали увеличению численности бифидобактерий [46].

В двух рандомизированных интервенциональных исследованиях, проводимых в слепом режиме, по изучению детей первого года жизни выявили безопасность применения 2’FL с точки зрения роста и толерантности в сочетании с GOS или фруктоолигосахаридами (FOS) [47, 48] (Kajizer et al. 2016 FASEB J). Дети, получавшие формулу для искусственного вскармливания, обогащенную 2’FL (0.2 или 1 г/л) в сочетании с GOS или только GOS, показали темпы роста, соответствующие показателям детей, находящихся на грудном вскармливании, до достижения возраста 4 месяцев (n=314). В подгруппе детей первого года жизни было проведено измерение иммунных маркеров в плазме при первичном обследовании и при стимуляции клеток крови RSV. В целом, иммунный профиль соответствовал профилю детей, находящихся на грудном вскармливании, при обогащении формулы для искусственного вскармливания 2’FL в более низкой или более высокой дозе [48]. По данным другого рандомизированного контролируемого исследования формуластартер для искусственного вскармливания, обогащенная 2 ОГМ, 2’FL и LNnT, (n=88) позволяла, в случае ее применения у доношенных детей, достигнуть показателей роста, соответствующих возрасту, а также хорошо переносилась по сравнению с потреблением той же формулы без ОГМ (n=87) [49]. Интересно отметить, что вторичным результатом данного исследования было выявление связи между кормлением формулой для искусственного вскармливания, обогащенной двумя ОГМ, и меньшим количеством случаев заболевания дыхательной системы, а также более редким использованием соответствующих препаратов (особенно антибиотиков и жаропонижающих) в течение первого года жизни и после 6 месяцев кормления. В возрасте 3 месяцев общий профиль микробиоты у детей, получавших формулу с 2 ОГМ, изменялся и начинал отличаться от группы потребления контрольной формулы в направлении профиля детей, получавших грудное вскармливание (контрольная группа). Этот сдвиг происходил, преимущественно, по причине увеличения количества Bifidobacterium одновременно со снижением количества Escherichia и Peptostreptococcaceae [50]. Значительно большее количество детей, получавших формулу с 2 ОГМ, характеризовалось составом микробиоты, типичным для детей, находящихся на грудном вскармливании, по сравнению с группой, потреблявшей необогащенную формулу, у которых состав микробиоты был исходно другим. Интересно отметить, что дети с составом микробиоты, структурно типичным для контрольной формулы, имели в 2 раза более высокий риск необходимости применения антибиотиков в течение первого года жизни по сравнению с теми детьми, микробиота которых соответствовала профилю, наблюдаемому у детей, находящихся на грудном вскармливании [51].

Эти первые клинические интервенциональные исследования со специфическими ОГМ показывают безопасность применения указанных веществ для роста ребенка и толерантности пищеварительной системы. Кроме того, как можно предполагать на основании базовых и наблюдательных исследований, 2’FL и LNnT могут способствовать защите от заболеваний, связанных с инфекциями, а также снижению необходимости лечения антибиотиками, возможно, посредством изменения процесса формирования первичной микробиоты кишечника.

Состав ОГМ зависит, главным образом, от статуса матери по FUT2 и FUT3. Данное явление, скорее всего, является результатом селективного эволюционного давления, связанного с воздействием патогенов или микробиома в целом. На разных этапах лактации происходит изменение состава ОГМ, что, возможно, указывает на изменение потребностей ребенка на разных этапах послеродового развития. Однако рождение недоношенных или доношенных детей, находящихся на разных стадиях развития, по всей видимости, не влияет на состав ОГМ в грудном молоке. Результаты клинических наблюдательных исследований в сочетании с данными доклинических исследований и клинических интервенциональных исследований подтверждают роль отдельных ОГМ в обеспечении иммунной защиты, преимущественно, от инфекционных заболеваний и применения антибиотиков. Требуется проведение дополнительных клинических исследований, тщательно спланированных наблюдательных исследований и, что особенно важно, интервенциональных исследований под контролем плацебо, чтобы получить дополнительные доказательства и углубить наши представления о биологии ОГМ и их значении для питания детей первого года жизни.

Мы благодарим Д-ра Питера Дункана (Peter Duncan) и Д-ра Анник Мерсеньер (Annick Mercenier) за критический обзор рукописи и оказанную поддержку.

Все авторы являются сотрудниками Нестек Лтд. (Nestec Ltd.)

Вопросы регулирования, связанные с применением олигосахаридов грудного молока

Сеппо Салминен

Форум по функциональным продуктам питания, Факультет медицины, Университет Турку

Турку, Финляндия

Серия семинаров Института питания Нестле, том 88, стр. 161–170, 2017.

Олигосахариды грудного молока являются его основными компонентами, при этом их состав и концентрация в значительной степени варьируют. С точки зрения регулирования применения, олигосахариды грудного молока классифицируются как новые продукты питания или новые ингредиенты продуктов питания, которые должны пройти проверку на безопасность. Кроме того, если планируется использовать какие-либо формулировки, связанные с влиянием ОГМ на здоровье, должны применяться правила регулирования для подобного рода заявлений. В данной главе рассматриваются, какие правила регулирования и исследования олигосахаридов грудного молока необходимы для возможности реализации ОГМ на рынке Европейского союза или Соединенных Штатов Америки, а также в любых других регионах мира. В качестве примеров рассматриваются лакто-N-неотетраоза и 2-фукозиллактоза, безопасность которых изучена в Европейском союзе или Соединенных Штатах Америки.

Олигосахариды грудного молока (ОГМ) представляют собой группу сахаров, в структурном отношении соответствующих неконъюгированным гликанам. ОГМ содержатся в грудном молоке, причем состав ОГМ уникален для каждой женщины в период лактации [1]. Ранее ОГМ не использовались в каких-либо других видах продуктов, и, следовательно, обогащение пищи ОГМ требует проведения как оценки безопасности, так и, вероятнее всего, изучения потенциального положительного влияния на состояние здоровья [2–5].

В то время как, по имеющимся данным, ОГМ оказывают влияние на развитие микробиоты кишечника в организме ребенка первого года жизни, не вполне понятно, действительно ли ОГМ влияют на состав микробиоты грудного молока или полости рта, носоглотки, желудочно-кишечного тракта или мочевыводящих путей [6, 7]. Однако, ОГМ действительно играют роль в первичной колонизации кишечника у ребенка первого года жизни, действуя как модифицирующий и потенциально защитный фактор, специфичный для системы «мать-ребенок» в течение беременности и периода грудного вскармливания [8]. ОГМ в настоящее время рассматриваются как новые ингредиенты формул для искусственного вскармливания, других продуктов питания, а также пищевые добавки. Это положение требует реализации определенных регулирующих мероприятий, разработка которых продолжается в нескольких странах и регионах.

В последнее время отмечается рост количества проблем, связанных с новыми ОГМ, причиной чего является увеличение интенсивности исследований по оценке влияния ОГМ и появление возможности их масштабного производства. ОГМ представляют собой новое средство изменения микробиоты кишечника и, в этой связи, могут быть полезны для здоровья младенцев, детей и взрослых. Такие ингредиенты пищи востребованы, так как в последнее время постоянно подчеркивается важность влияния микробиоты кишечника на состояние здоровья. ОГМ можно рассматривать как пребиотики, а также специфические компоненты, применение которых нацелено на получение определенных исходов, при этом, предположительно, эти вещества характеризуются функциональностью.

В большинстве стран ОГМ описываются в соответствующей документации как новые продукты питания, и, следовательно, требуется, чтобы несколько организаций, занимающихся выдачей разрешения для продуктов питания, провели обязательную оценку безопасности.

Регулирующие положения, определяющие введение новых продуктов питания, в значительной степени отличаются в разных регионах. В некоторых случаях путаница может привести к разному пониманию таких терминов как «новый продукт питания» и «функциональный продукт питания». В то же время в Европейском союзе, например, регулирующая категория функциональных продуктов питания сформирована с учетом продуктов, для которых Европейская комиссия одобрила заявления о пользе для состояния здоровья. Принципиальное различие между этими двумя категориями продуктов питания  то, что новые продукты питания должны быть оценены на предмет безопасности, тогда как продукты питания с заявлениями о пользе для состояния здоровья должны оцениваться на соответствие эффектов их применения любым желаемым нутрициологическим, функциональным утверждениям или заявлениям о снижении риска определенных заболеваний. На Рисунке 1 показано, что разработана довольно четкая терминология, но иногда продукты питания и пищевые ингредиенты попадают в обе категории, что вызывает необходимость оценки как безопасности, так и эффективности. В Европе оценка по 2 категориям чаще всего применяется к ОГМ.

Взгляды на современное законодательство США, Европы, а также некоторых других стран, как и характерные юридические проблемы, представлены в зависимости от оценки ОГМ и их статуса как нового продукта питания с точки зрения регулирующих органов и научных представлений. Кроме того, обсуждается возможность будущих заявлений о пользе ОГМ для состояния здоровья.

ОГМ являются естественными компонентами, способными воздействовать на микробиоту кишечника за счет обеспечения энергией полезных микроорганизмов, а также возможного действия в качестве «ловушек» для инактивации потенциальных и оппортунистических патогенов на поверхности слизистой для улучшения здоровья ребенка. Особый интерес представляют исходы, обеспечивающие поддержание состояния здоровья, так как известна важность микробиоты кишечника для обеспечения здоровья всего организма. Регулирующие положения, определяющие введение ОГМ, варьируют в зависимости от географического региона. Новые продукты питания и продукты питания с заявленной пользой для состояния здоровья подпадают под специфические правила в нескольких странах. Основные требования регулирующих положений в ЕС и США аналогичны, но процесс получения разрешения отличается. Существует ряд вопросов, которые должны быть рассмотрены при любой оценке безопасности новых пищевых ингредиентов (НПИ).

В разных странах мира регулирующие положения, определяющие применение новых продуктов питания, функциональных продуктов питания, а также традиционных продуктов питания, различаются. В ЕС введение новых продуктов питания, которые не применялись в ЕС до 15 мая 1997 г., в настоящее время регулируется в соответствии с «Правилами регулирования потребления новых продуктов питания (EC) 285/97» [5]. Эти «Правила» четко определяют этапы оценки риска, необходимой для получения разрешения на применение любого нового продукта до того, как продукт сможет попасть на рынок ЕС. В данном документе также представлена концепция «существенной эквивалентности» часто применяемым продуктам питания, в этом случае используется упрощенная уведомительная процедура. В документе также определена роль государствчленов ЕС в процессе выдачи разрешения. Одно государство-член ЕС несет ответственность за первичную оценку безопасности нового продукта питания. Другие государства-члены ЕС часто подробно проверяют первичную оценку или задают дополнительные вопросы по безопасности новых продуктов питания. В этих случаях все моменты, вызывающие сомнения, обычно обсуждаются и разъясняются в соответствии с оценками комитета Европейского агентства по продовольственной безопасности (EFSA). В итоге решение, разрешающее применение продукта, принимается либо государством-членом ЕС, которое руководит ЕС в данный момент, либо Европейской комиссией, в которой участвуют все государства-члены ЕС. В обоих случаях разрешение действует на всей территории ЕС.

«Правила регулирования потребления новых продуктов питания 1997 г.» были изменены, и новый документ вступил в силу с января 2018 г. Наиболее существенным изменением является переход к полностью централизованной системе ЕС. Досье представляются в Европейскую комиссию, EFSA несет ответственность за оценку безопасности, при этом разрешения являются общими, то есть обязательны к исполнению для всех без дополнительного уведомления. Изменения правил также касаются вопросов, связанных с традиционными продуктами питания из стран третьего мира. В настоящее время предусмотрен переходный период продолжительностью 2 года, в течение которого прежние механизмы продолжают действовать.

На основании действующего законодательства компетентные органы государств-членов ЕС и Европейской комиссии оценивают, имеет ли продукт питания или ингредиент продукта питания историю безопасного применения до 1997 г. в Европе, при отсутствии такой истории продукт или ингредиент продукта идентифицируются как «новые». В соответствии с положением требуется обширная оценка безопасности продукта питания или ингредиента для допуска на рынок ЕС [4]. Перечень разрешенных новых продуктов питания и нового ингредиента продукта питания (НПИ) представлен в открытом реестре EC. Решения разъясняются в инвентарной ведомости, где уточняются вопросы, связанные с вариантами применения и ограничениями использования каждого нового продукта питания или нового компонента продукта питания, процесса или НПИ (http://ec.europa.eu/food/safety/novel_food/authorisations/list_ authorisations/index_en.htm). Что касается бактерий, добавляемых в продукты питания, которые также могут считаться новыми ингредиентами, ежегодно выпускается обновленный перечень микроорганизмов, добавляемых с определенной целью в продукты питания (QPS, «Обоснованное предположение о безопасности микроорганизмов в продуктах питания и кормах»), и этот документ является основой для признания микроорганизмов на видовом уровне безопасными для применения в составе продуктов питания и кормов в ЕС (EFSA, обновление 2016 г.). Учитывая возможность воздействия на микробиоту, оценка безопасности олигосахаридов грудного молока также может отчасти быть связана с микробиотой.

Новые пребиотики могут быть компонентом традиционных продуктов питания, пищевых добавок или продуктов питания, предназначенных для определенных нутрициологических целей. К продуктам питания, содержащим новые ингредиенты, относят также продукты, созданные для обеспечения специфических пищевых потребностей, например, формулы для искусственного вскармливания детей первого года жизни и формулы для последующего питания, обработанные продукты на основе злаков, продукты, предназначенные для медицинских целей, а также продукты для полной замены рациона, применяемые для контроля веса.

До настоящего времени 2 ОГМ были изучены в исследованиях по оценке безопасности в Европе, при этом были получены положительные результаты и выдано разрешение на применение Европейской комиссией.

2’ - O -фукозиллактоза (2’ -FL) представляет собой трисахарид, состоящий из L-фукозы, D-галактозы и D-глюкозы, который производится с использованием L-фукозы и D-лактозы в качестве сырья. Данный новый пищевой ингредиент (НПИ) предназначается, в соответствии с документами заявителя, для использования в формулах для искусственного вскармливания и формулах для последующего питания, продуктах питания для специальных медицинских целей для детей первого года жизни и детей более старшего возраста, а также других продуктах питания для детей первого года жизни и детей более старшего возраста. НПИ также предназначен для использования в продуктах питания или в составе пищевых добавок для взрослых [3].

Лакто-N-неотетраоза (LNnT)  это синтетический тетрасахарид, включающий D-галактозу, N-ацетил-D-глюкозамин, D-галактозу, а также D-глюкозу, который производится с использованием Dлактозы в качестве сырья. По утверждению заявителя, НПИ предназначен для использования в формулах для искусственного вскармливания и формулах для последующего питания, продуктах питания для специальных медицинских целей для детей первого года жизни и детей более старшего возраста, а также других продуктах питания для детей первого года жизни и детей более старшего возраста. НПИ также предназначен для использования в продуктах питания или в составе пищевых добавок для взрослых [4]

Третья оценка безопасности была проведена EFSA для 2’-Oфукозиллактозы в сочетании с лакто-N-неотетраозой, применяемых в качестве пищевой добавки для детей [5] .

Государства-члены ЕС подняли несколько вопросов после первичной оценки безопасности. В частности, рассматривались следующие проблемы:

2’ - O -Фукозиллактоза [4]

• В досье указывается, что потребление 2’-FL в форме пищевых добавок не может влиять на общее ежедневное потребление. Однако необходимо рассмотреть возможность сочетанного потребления 2’-FL из пищевых добавок и других продуктов, указанных в досье, как реалистичный сценарий, при котором возможно примерное удвоение ежедневного потребления для лиц, в рацион которых входит большое количество этих продуктов.
• Учитывая, что НПИ также могут быть компонентом рациона более уязвимых групп людей, например, имеющих заболевания, сопровождаемых так называемым синдромом повышенной кишечной проницаемости, любая дополнительная информация может быть предоставлена при наблюдении возможных последствий, которые могут быть связаны с повышенным уровнем всасывания НПИ.
• Потребление больших количеств неперевариваемых углеводов может быть причиной появления слабительного эффекта. Поскольку не существует исследований с участием человека по применению 2’-FL, помимо детей (причем изучение проводилось только в группе детей, получавших грудное вскармливание), ничего точно не известно о количествах 2’-FL, применение которых может вызывать слабительный эффект.
• Потенциал для генотоксичности был оценен только в 2 тестах in vitro на предмет мутагенности. Тест на потенциальную кластогенную активность не проводился (тест in vitro на микроядра или тест in vitro на хромосомные аберрации). Отсутствие генотоксичности для этого препарата 2’-FL может быть продемонстрировано в достаточном объеме только при получении благоприятных исходов такого исследования.

Лакто-N-неотетраоза [5]

• Требуется подтверждение, что растворители, применяемые для этого вещества, приемлемы для потребления в качестве ингредиентов продуктов питания.
• Вычисленное потребление для определенных популяционных групп, на основании данных по потреблению из Великобритании, составляет от 26 до 329 мг/кг веса тела в день для 95-го процентиля. Однако эти показатели потребления не включают потенциальное дополнительное потребление LNnT из пищевых добавок, как указывается в заявлении.
• Потребление больших количеств неперевариваемых углеводов может быть связано со слабительным эффектом. Поскольку не проводилось исследований по применению LNnT с участием человека, помимо исследований по изучению детей, находящихся на грудном вскармливании, нельзя делать какиелибо заявления по вопросу о том, какие уровни потребления LNnT могут приводить к появлению слабительного эффекта.

«Правило EC по регулированию вопросов, связанных с питанием, а также заявлений о пользе для состояния здоровья 1924/2006» требует, чтобы такие заявления основывались на научных доказательствах и приемлемости. EFSA разработало научное и техническое руководство по представлению заявлений о пользе для состояния здоровья для продуктов питания [9]. Недавно было показано, что «Руководство EFSA» [10] или «Директива PAR-NUTS 2009/39/EC» или «Правила ЕС 609/2013» исключают возможность обойти требование документа о формулировании заявления о пользе для состояния здоровья «Правило 1924/2006». Хендриксен (Hendriksen) и Верхаген (Verhagen) [11] разработали схему принятия решения для того, чтобы можно было различать продукты питания PARNUTS от обычных продуктов питания (с учетом заявления о пользе для состояния здоровья). После публикации «Правила о формулировании заявления о пользе для состояния здоровья 1924/2006», EFSA рассмотрело примерно 3000 заявлений о пользе для состояния здоровья для научного подтверждения.

В Соединенных Штатах Америки оборот всех продуктов питания и пищевых ингредиентов регулируется в соответствии с «Актом по продуктам питания и косметическим средствам» (FDCA). В США безопасность новых и недостаточно изученных продуктов питания (включая ОГМ) является, преимущественно, ответственностью производителя продукта питания. Законодательство постулирует следующее:

«Любое вещество, предназначенное для использования в качестве ингредиента продукта питания, является пищевой добавкой, подпадающей под требование проведения исследования до начала реализации на рынке и должно быть разрешено Агентством по продуктам питания и лекарственным препаратам (АПЛ). Исключением является ситуация, когда вещество широко известно квалифицированным экспертам, и его безопасность была адекватно продемонстрирована в условиях предполагаемого применения».

В США ОГМ, предназначенные для использования в качестве ингредиентов продуктов питания, отличных от пищевых добавок, регулируются в соответствии с тем же законодательством, как и все другие пищевые ингредиенты. Это значит, что они могут применяться в статусе пищевых добавок или веществ GRAS (вещества, общепризнанные как безопасные), по решению производителя. Существуют два другие условия, которые имеют отношение к веществам GRAS. Во-первых, информация, демонстрирующая безопасность, должна быть предоставлена в открытом доступе для научного сообщества, обычно в этой связи подразумевается необходимость публикации данных в рецензируемой научной литературе. Во-вторых, в научном сообществе должна в целом признаваться безопасность такого рода веществ – вопрос безопасности не должен стоять на повестке дня.

АПЛ не играет решающей роли в определении статуса GRAS, ограничиваясь только рекомендательными функциями. Закон, в соответствии с которым присваивается статус GRAS («Дополнение FDCA по пищевым добавкам от 1958 г.»), специально исключил вещества GRAS из обязательного перечня АПЛ для проведения исследований и выдачи разрешений до того, как вещество будет указано в реестре как продукт питания. Статус GRAS для предполагаемого применения ОГМ определен группой квалифицированных ученых, которые высказали мнение, что существует «разумное основание для уверенности в том, что эти вещества не могут причинить вред» при условии соответствия предполагаемому применению, а также, помимо этого, что, в соответствии с представлениями членов данной рабочей группы, другие ученые такого же уровня квалификации могут придти к аналогичному выводу. Этот процесс может быть определен внутренним регламентом компании, а результаты могут быть конфиденциальными и распространяться только внутри компании, при этом раскрытие данной информации клиентам может осуществляться только на условии конфиденциальности.

В 1997 г. закон был изменен для того, чтобы включить возможность уведомительной процедуры признания статуса GRAS, при помощи которой компании могли бы направлять заявления в АПЛ. Процедура подачи документов обычно включает оценку существующих данных группой признанных экспертов. Такая оценка безопасности посредством научного исследования требует того же количества и качества научных доказательств. Данное условие связано с необходимостью получения разрешения на использование вещества в качестве пищевой добавки, обычно за основу принимаются результаты опубликованных исследований, которые могут быть подтверждены, в том числе, неопубликованными данными, а также иными сведениями и другой информацией. Процедура подачи документов является добровольной, при этом АПЛ изучает информацию, а положительный ответ АПЛ дается в форме заключения «АПЛ не имеет вопросов на данный момент времени».

ОГМ очень давно применяются в питании детей, будучи компонентами грудного молока. Однако состав ОГМ варьирует, при этом ОГМ не встречаются в других продуктах питания. Для новых и недостаточно изученных ОГМ путь на рынок в качестве пищевой добавки заключается в получении статуса GRAS на основании длительности безопасного использования, а после  использования в качестве пищевой добавки на том же основании и в той же форме. Для 2’-O-фукозиллактозы, 2’-фукозиллактозы, а также лакто-N-неотетраозы были представлены следующие уведомления:

2’-O-фукозиллактоза (Glycom A/S). Предназначена для использования в качестве компонента формулы для искусственного вскармливания доношенных детей первого года жизни в максимальном количестве 2400 миллиграммов/литр. Кроме того, данное вещество предназначено для использования в продуктах, полученных при помощи выпекания, и смесях для выпекания, напитках и основах для напитков, кофе и чае, аналогах пищевых продуктов, продуктах питания для детей первого года жизни и детей, начавших ходить, продуктах из злаков и пастах, молоке (цельном и снятом), обработанных фруктах и соках, обработанных овощах и соках, а также заменителях сахара в максимальных количествах от 0.084 до 2.4 грамм/порция [12].

2’ -Фукозиллактоза (Jennewein Biotechnologie, GmbH). Предназначена для использования в качестве ингредиента формул для искусственного вскармливания детей первого года жизни и детей, начавших ходить, в количестве не более 2 грамм 2’-фукозиллактозы на литр формулы для искусственного вскармливания [13]

Лакто-N-неотетраоза (Glycom A/S). Предназначена для использования в качестве компонента формулы для искусственного вскармливания доношенных детей первого года жизни в максимальном количестве 600 миллиграммов (мг)/литр. Кроме того, данное вещество предназначено для использования в продуктах, полученных при помощи выпекания, и смесях для выпекания, напитках и основах для напитков, кофе и чае, аналогах пищевых продуктов, продуктах питания для детей первого года жизни и детей, начавших ходить, продуктах из злаков и пастах, молоке (цельном и снятом), обработанных фруктах и соках, обработанных овощах и соках, а также заменителях сахара в максимальных количествах от 0.02 до 1.2 грамм/порция [14] .

В Японии оценка степени новизны основывается на источнике и традиционном использовании продуктов питания или пищевых ингредиентов на территории Японии. В настоящее время подробные сведения по новым ОГМ отсутствуют.

На указанную дату (август 2016 г.) не зарегистрировано заявлений по ОГМ.

Было проведено несколько исследований in vitro и даже исследований с участием человека для того, чтобы спрогнозировать потенциальную возможность упоминания ОГМ в заявлениях о пользе для состояния здоровья в Европе и США. Примером обоснования заявления о пользе для здоровья является вопрос о применении пробиотиков и пребиотиков [15]. Важно помнить, что отдельные ОГМ и их сочетания образуют сходные продукты для тестирования, и, в этой связи, требуется внимательное рассмотрение и корректировка до начала проведения интервенциональных исследований с участием человека.

Области, представляющие интерес, включают изучение связи применения ОГМ и некротизирующего энтероколита, использование микроорганизмов для различных провоцирующих воздействий для выяснения последствий для кишечника, изучение диареи путешественника, а также отдаленных последствий применения ОГМ в контексте влияния на способности к обучению по данным экспериментов на крысах [16–20].

Сведения об ОГМ в контексте регулирования их применения в Соединенных Штатах Америки и Европейском союзе:

• В ЕС ОГМ считаются новыми продуктами питания/НПИ, при этом 2 олигосахарида и их сочетание прошли процедуру проверки безопасности.
• В США 3 ОГМ прошли оценку безопасности в соответствии с уведомительной системой GRAS.
• В ЕС «Правила регулирования потребления новых продуктов питания» изменены и окончательно вступят в силу в 2018 г.; система выдачи разрешений будет модифицирована, кроме того, EFSA установит новые правила для подачи заявлений.
• В ЕС или США не принято заявлений о пользе для состояния здоровья в связи с потреблением ОГМ, при подаче соответствующих заявлений потребуется документальное подтверждение эффективности.
• Схема регулирования потребления ОГМ различается в разных географических регионах. Таким образом, можно прогнозировать существование различий в интерпретации данных по безопасности и потенциальных заявлений, связанных с применением ОГМ.

Конфликт интересов отсутствует.